抗生素是改善人类健康的最重要发现之一，通过预防细菌感染而发挥作用。然而，抗生素耐药性削弱其在了临床领域、寿命和安全食品生产方面的进展动能作用。这一现象进一步恶化是由于抗生素研发渠道的减少，自20世纪90年代，新抗生素的研发和商业化进展已经减缓[1]。即使新的抗生素可以继续保护人们免受细菌的侵害，但抗生素的滥用会让细菌不断进化成长，人们的健康情况又将面临非常严重的威胁[2]。抗生素胁迫下存活的菌株不仅可以把抗性基因传给其他的宿主，甚至可以影响到其他的群落的生长[3]。据估计，若不限制抗生素滥用，到2050年，将会有1 000万人死亡；除了对人们生命的巨大威胁之外，届时，微生物耐药性还将造成3 000亿~10 000亿美元的经济损失[4-5]。因此，我们需要通过采取各种措施来限制微生物耐药性对人们生命和经济的威胁。

本文选取2023年5月无锡市某三甲医院的病人体内分离出来的大肠杆菌进行药敏实验。本研究对其结果进行了统计以及数据分析，旨在了解当下最新的大肠杆菌的耐药情况与特点，进而为临床提供用药建议，也可以更好地进行耐药菌株防控。

1 实验部分

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 EDL933，ΔLuxS，C7菌株由本实验室提供。EDL933为质控菌株，ΔLuxS为实验室保存的缺失luxS基因的大肠杆菌菌株，C7菌株为实验室保存的食源性大肠杆菌。75株已鉴定过的大肠杆菌由无锡市某三甲医院馈赠。详细来源见表1。

1.1.2 药品与试剂 麦康凯琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）；MH培养基（杭州微生物试剂有限公司）；氯化钠、氨苄西林、诺氟沙星、环丙沙星、盐酸四环素、氯霉素[生工生物工程（上海）股份有限公司]；胰蛋白胨、酵母提取物（北京拜尔迪生物技术有限公司）；复方新诺明、卡那霉素、头孢噻吩（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.3 仪器和设备 MQD-S3R振荡培养箱（上海旻泉仪器有限公司）；Multiskan FC型酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]；BSC-1600ⅡA2生物安全柜(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 药敏试验 从LB平板上挑取单菌落至LB液体培养基中，在37 ℃，180 r/min条件下过夜培养至对数生长，菌密度达到0.5麦氏单位。将8种抗生素母液按照梯度稀释的方法，分别稀释到1 024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL。吸取各浓度抗生素100 μL，加入96孔板中，同时加入制备好的菌液，将96孔板盖上盖子放入恒温摇床中37 ℃，180 r/min培养12~16 h，培养完成后测量600 nm波长下的吸光度值，得到每个孔内菌的生长情况，得到最小抑菌浓度。所有标准参考《抗菌药物敏感性试验性能标准》（M100—2021） ，如表2所示。试验重复3次，数据以均值±标准差表示。

1.2.2 传代实验 选取EDL933、ΔLuxS、C7菌株和19193号菌株作为实验对象进行耐药进化实验，初始传代浓度为各抗生素的1/2耐药率（minimun inhibitory concentration，MIC）。传代30 d后进行3种抗生素的最小抑菌浓度测定。之后再对进化至30 d的耐药菌进行5 d的无抗生素条件的传代培养，测定其8种抗生素的最小抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 标本分布

一共从医院得到75株捐赠的大肠杆菌，如表3所示这些菌株从尿、血、胆汁、痰、分泌物、穿刺液、脓液等分离而来。其中以尿、腹水、血分离出来的为主，占80%（60/75）。

表3 2023年5月无锡市某医院大肠杆菌来源

Table 3 Sources of E. coli in a hospital in Wuxi City in

May 2023

[标本来源 标本数量 多重耐药菌分数（比例） 尿 43 46.6%（35/75） 血 9 6.67%（5/75） 分泌物 1 0.00%（0/75） 穿刺液 1 1.33%（1/75） 脓液 4 1.33%（1/75） 痰 6 4.00%（3/75） 腹水 8 9.33%（7/75） 胆汁 3 4.00%（3/75） 合计 75 73.33%（55/75） ]

2.2 药敏试验结果

这些大肠杆菌都是来源于病人，可以通过这75株大肠杆菌药敏结果对无锡市地区耐药情况有个初步的了解，这说明无锡市的耐药情况已经比较严重。由表4可知，这8种抗生素的耐药率由高到低分别是氨苄西林（92%，69/75）、环丙沙星（60%，45/75）、诺氟沙星（53.3%，40/75）、头孢噻吩（52%，39/75）、复方新诺明（49.3%，37/75）、四环素（45.3%，34/75）。而大肠杆菌对卡那霉素和氯霉素则相对敏感，分别仅有12%和13.3%。

表4 8种抗生素的耐药率情况

Table 4 The resistance rate of 8 kinds of antibiotics

[药物种类 药物名称 耐药率 β-内酰胺类 氨苄西林 92.0%（69/75） 喹诺酮类 环丙沙星 60.0%（45/75） 喹诺酮类 诺氟沙星 53.3%（40/75） 四环素类 四环素 45.3%（34/75） 氨基糖苷类 卡那霉素 12.0%（9/75） 磺胺类 复方新诺明） 49.3%（37/75） 头孢类 头孢噻吩 52.0%（39/75） 氯霉素类 氯霉素 13.3%（10/75） ]

2.3 大肠杆菌多重耐药分析

在这75株菌株中，耐药情况已经非常严重。仅有1株大肠杆菌对8种抗生素均不耐药，完全敏感株仅占1.33%，而多重耐药株则高达73.3%。这批菌株中多重耐药数最多的3种分别是4耐，5耐和2耐，其占比分别为26.6%（20/75），18.6%（14/75），16%（12/75）（见图1）。说明本批实验的大肠杆菌耐药性比较严重。

<G:\武汉工程大学\2025\第2期\叶正超-1.tif>[0 1 2 3 4 5 6 7 8

多重耐药数][20

15

10

5

0][样品个数]

图1 大肠杆菌多重耐药性分析

Fig. 1 Multidrug resistance analysis of E. coli

2.4 不同抗生素处理下的EDL933、ΔLuxS、C7和19193号菌株的耐药进化性

在本实验中，19193号菌株为75菌株中的唯一全敏感菌株。群体感应是细菌之间的一种交流行为，它涉及细菌间的方方面面如抗生素合成，生物被膜的生长，自由基的形成等诸类可能对细菌的耐药性产生影响的行为。

如图2所示，在氯霉素（chloramphenicol，CM）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、四环素（tetracycline，TCY）的胁迫下，这4株实验菌株对这些抗生素的耐药性都有不同程度的增加。与EDL933相比，ΔLuxS的耐药进化速度明显降低。在CM的胁迫下，ΔLuxS最终达到了32 μg/mL的耐药性，EDL933达到了64 μg/mL的耐药性。TCY的情况和CM的情况相同。而在Kan的胁迫下，虽然ΔLuxS和EDL933最终并没有达到耐药的程度，但是在30 d之后，这2株菌株的耐药程度也大幅上涨。这说明少了luxS后，影响了AI-2的合成，最终导致缺失株相较于正常的大肠杆菌是缺少了群体感应的，而这个很有可能也是影响了其耐药进化性的原因。通过多次诱导，菌株的最小抑菌浓度增加是普遍现象，但并非一定。比如Kan胁迫下的19193号菌株和TCY胁迫下的C7菌株，这2种菌株分别在各自的抗生素胁迫下传代了30 d，但是并没有产生MIC的变化。因此，菌株在抗生素胁迫下的耐药进化是一种大趋势，但并非一定。

2.5 不同抗生素处理下的EDL933、ΔLuxS、C7和19193号菌株的耐药稳定性

通过30 d抗生素胁迫进化，不同大肠杆菌菌株的MIC大部分显著上升。但是这种耐药进化并不能确定在耐药胁迫后是否会回归到初始耐药水平。因此，将之前已经进化到30 d的耐药菌株，进行了5 d无抗生素的传代培养。结果如图3所示，所有菌株在无抗生素胁迫的传代后MIC均未发生显著变化，这表明实验菌株的耐药性在抗生素长期胁迫下发生改变，且可被稳定遗传。

3 结 论

目前，多重耐药菌对人们的影响已经到生活的方方面面，越来越多的人被感染，增加人类的死亡率[6]，人类公共卫生安全不断受到挑战。本实验获取医院病人的最新菌株，其实验结果可以清晰地呈现当下病人体内细菌的耐药情况。而大肠杆菌作为一种人们最熟知和最常见的细菌，用来选作实验对象具有代表性。本研究共有75株大肠杆菌作为实验对象，其中多重耐药菌占73.3%，结果表明，现今的耐药情况已较严峻。在参与实验的抗生素中，大肠杆菌仅对卡那霉素和氯霉素敏感。其余6种抗生素的耐药率都比较高。这与程然等[7]研究类似，其在研究75株大肠杆菌耐药性情况时，环丙沙星（53.9%），复方新诺明（59.8%），氨苄西林（92%）等抗生素的耐药性也都超过了50%。张胜勇等[8]也发现大肠杆菌对氨苄西林（100%），环丙沙星（69.39%），复方新诺明（75.51%）的耐药性较高,大肠杆菌对氯霉素（9.18%）的耐药性较低。但是其研究得出的大肠杆菌对四环素耐药性较低（4.08%），与本实验结果不一致，这可能是受各地区样本环境不同的影响（本文样本仅来自单一医院，仅反应该医院情况）。

在耐药进化实验中，选取了75株菌株中唯一对8种抗生素全部敏感的19193号菌株进行实验。在被抗生素多次诱导后，其本身的最小抑菌浓度就很有可能显著增加。因此不能完全靠抗生素来解决问题，需要在源头对病原菌进行消灭和遏制，一旦有所残留，通过大量的诱导，很有可能最终成为“超级细菌”。李悦[9]在研究铜绿假单胞菌的耐药进化时，通过不同抗生素20 d的传代后，铜绿假单胞菌对环丙沙星的MIC提高了16~256倍。在头孢他啶和阿米卡星的胁迫下，细菌的MIC提高了128倍。MIC的显著增加都显示耐药进化的严重性。

通过EDL933和ΔLuxS的耐药进化实验对比，发现缺少了群体感应的菌株，在面对抗生素的环境胁迫时，耐药进化不如普通菌株。这也可能暗示着群体感应的存在影响细菌抵抗外部环境的能力。GARCíA-CONTRERAS等[10]发现绿脓假单胞菌群体感应系统lasR基因缺失后，缺失株在热、渗透压、重金属离子的压力下，其本身的抵抗外部环境的能力都有明显减弱。

细菌可以不断进化，提高自身对抗生素的耐受性。张胜勇等[8]在河南省新郑市在2020年检出的多重耐药大肠杆菌占比占全部病原菌的46.01%。谭萍等[11]在研究深圳市某三级医院2016至2020年的多重耐药大肠杆菌时，发现多重耐药大肠杆菌在全部病原菌的占比一直在50%左右。彭玲等[12]在研究上海市大肠杆菌的耐药情况时，发现大肠杆菌对氨苄西林等7种抗生素的耐药性都超过了50%，且在不断地增加。这都表明了多年来临床上抗菌药物的广泛应用，抗生素虽然可以帮助病人，但是其也是导致多重革兰氏阴性耐药菌大量出现的主要原因[13]，这也对人们的生命健康造成了巨大的威胁[14]。抗生素还通过滥用进入水产中[15]，人工养殖的南美白对虾中也检测出抗生素残留。近年来，多重耐药菌数量的快速增加[7]，加剧了医疗风险，威胁人民群众的健康安全。对于细菌耐药性以及多重耐药菌的研究任重而道远。