月经不调作为妇科领域的常见问题，常给女性日常起居带来困扰，表现为月经周期的紊乱或出血量的异常，或是由月经引起的腹痛。月经不调的发病原因较为复杂，为多个系统相互作用。其中，内分泌系统的紊乱可以影响卵巢的功能，进而导致激素分泌失衡，引发疾病；而血液流变学的异常则可能影响子宫的血液循环，进而影响月经排出，也会引发疾病[1]。现阶段，临床治疗月经不调的手段丰富多样，在各类疗法中，西药治疗属于较为常用的手段之一。但容易产生不良反应，导致依赖的问题。为此，中医学者主张运用传统中药治疗方案，且该疗法已在临床实践中体现出较好的疗效。高文俊等[2]通过中医理论提及了治疗月经不调讲究阴阳平衡，受五脏六腑的调控，阳中有阴、阴中有阳，阴阳相互转化相互牵制，并且认为中医在治疗月经不调的关键在于肾阴、肾阳调节的主次变换。

四物汤作为一款经典传统治疗月经不调的基本方，主要由当归、川芎、白芍、熟地黄四味药材构成。四物汤药方最早记载于唐朝的蔺道人著的《仙授理伤续断秘方》，应用较为广泛的药方则是取自《太平惠民和剂局方》的记载[3]。一般来说，它具有补血调经的效果，可减缓女性的痛经，是中医补血、养血的经典药膳[4]，被后世医家称为“妇科第一方”、“调理一切血证”的“妇女之圣药”[5]。主治营血虚滞证，用于心悸失眠、头晕目眩、面色无华、血虚血瘀、胎动不安、产后恶露不下、月经不调、经少或经闭等妇科诸症[6]。四物汤中，熟地黄可发挥滋阴养血之效；白芍与当归侧重养肝补血；川芎则能行气活血，诸药配伍合用，共奏补血活血之功。文献[7]表明，四物汤可促进月经量恢复，缓解月经过少症状。另，文献[8]指出，四物汤能够帮助调节雌激素水平，推动月经恢复，进而提升治疗效果。

网络药理学以复杂生物网络为研究核心，能够系统解析疾病证候与药物作用机制的内在关联，这与中医药学强调的整体观念具有高度契合性[9]。而分子对接作为一种基于计算机模拟的结构导向型技术，已在药物研发领域得到广泛应用，其核心价值在于挖掘具有治疗潜力的新型化合物，并从分子水平精准预测配体与靶点的相互作用模式，同时为药物不良反应的预判提供重要参考[10]。本文研究采用网络药理学结合分子对接技术，研究四物汤治疗月经不调的作用机制，通过建立四物汤与月经不调靶点相互作用网络，为四物汤治疗月经不调提供理论参考。

1 实验部分

1.1 四物汤化学成分收集及靶点蛋白筛选

借助TCMSP数据库（https: //www.tcmsp-e.com/）开展检索，将“当归、川芎、白芍、熟地黄”作为检索关键词，以生物利用度≥ 30%且类药性≥ 0.18 为选择条件，获取该处方的主要活性成分，然后搜索成分的相关靶点，以获取核心处方中药物的主要活性成分及对应的潜在点。随后检索各活性成分对应的相关靶点，以明确处方中药物的核心活性成分及潜在作用靶点。对这些中药成分的潜在靶点进行整合并去除重复项后，通过 Uniport 蛋白质知识库（https: //www.uniprot.org）将靶点转换为基因名称，所得蛋白 ID 数据可支撑后续研究分析。

1.2 疾病靶点及药物靶点预测

在GeneCards（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、OMIM（https://omim.org/）和DrugBank（https://go.drugbank.com/）（go，即gene ontology，基因本体）3个数据库中，以“irregular menstruation”为关键词筛选相关疾病靶点，合并去重后得到月经不调的相关靶点。随后通过Venny 2.1.0 平台绘制韦恩图，得到交集靶点。

1.3 “四物汤-活性成分-疾病靶点”网络构建

使用Cytoscape 3.9.1软件构建四物汤治疗月经不调的“四物汤-活性成分-疾病靶点”网络图，以此直观呈现三者间的关联关系。

1.4 蛋白互作网络关系图构建

将交集靶点上传至String平台（https://cn.string-db.org/），得到蛋白质互作网络（protein interaction network，PPI） 图。依据degree值筛选核心靶点，将得到的数据导入 Cytoscape 3.9.1 软件，整理得到交集靶点-核心靶点的网络图。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将交集靶点导入 David 在线平台（https://david.ncifcrf.gov/），完成GO功能及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，结果导入微生信平台绘制气泡图，直观展示显著条目。

1.6 分子对接

从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载靶点对应的蛋白结构文件，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载关键成分的2D结构，运用AutoDock vina软件进行分子对接。一般认为结合亲和力小于-4.25 kJ/mol表示两者间具有一定的结合活性，小于-5.0 kJ/mol表示有较好的结合活性，小于-7.0 kJ/mol表示有强烈的结合活性[11]。

2 结果与讨论

2.1 四物汤活性成分及作用靶点

基于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）搜索，首次筛选出四物汤的活性成分为24个，其对应的作用靶点共206个，对上述结果进行合并去重后，最后得到活性成分20个，见表1，作用靶点113个。

2.2 月经不调相关靶点

从 GeneCards 数据库、Drugbank 数据库及 OMIM 数据库中检索获取与 “irregular menstruation” 相关的疾病靶点，经去重处理后，共得到“月经不调”相关疾病靶点2 821个。将上述 113 个核心处方的成分靶点与这些疾病靶点一同导入 Venny 2.1 网站进行交集分析，最终获得疾病-核心处方共同靶点 56 个，对应的韦恩图见图 1（其中蓝色代表“四物汤”核心处方成分的靶点，黄色代表“月经不调”的疾病靶点）。

2.3 “四物汤-活性成分-疾病靶点”相互作用的网络分析

把数据导入 Cytoscape 3.10.1 软件进行分析处理，同步导出相关数据及“四物汤 - 活性成分 - 疾病靶点”互作网络图，具体如图 2 所示。从该图中能够看出，四物汤通过多成分作用于多靶点的机制，对月经不调发挥治疗作用。

2.4 PPI网络的构建

将“药物-疾病靶点”的交集靶点录入 String 数据库开展分析，得到 PPI 图，具体如图 3 所示。此网络包含 56 个节点与 435 条边，其中degree值位列前十的节点分别为 IL6、TNF、ESR1、AKT1、PTGS2、BCL2、PPARG、TGFB1、GSK3B、PRKACA（详见表 2）。这一结果说明上述节点在 PPI 网络中占据核心地位，且节点间的联系较为紧密，相关图示见图 4。

2.5 GO和KEGG的富集分析

运用DAVID数据库进行 GO 和 KEGG 富集分析。GO功能富集分析共获得321个生物过程，主要为对外源性物质刺激的应答、对雌二醇的应答、基因表达的正向调控等，如图5所示；获得40个细胞组分，主要有含蛋白复合物、染色质、胞浆基质等，如图6所示；获得83个分子功能，主要有酶结合、核受体活性、雌激素应答元件结合等，如图7所示。KEGG富集获得88条信号通路，主要为癌症通路、脂质与动脉粥样硬化通路、卵巢类固醇生成通路等表现为较高的显著。最后通过微生信平台将结果可视化处理，见图8。

2.6 分子对接

以山奈酚、β- 谷甾醇、杨梅酮、豆甾醇、谷甾醇作为配体，将 IL-6、TNF、ESR1、AKT1、PTGS2 设定为受体，开展配体与受体的两两对接实验，最终获得 25 组对接数据。本研究中所有对接结果的最低结合能均为负值（表 3），提示对接效果良好。在分子对接过程中，最低分子结合能的数值越低，配体与受体形成的结合构象稳定性越强。结果显示AKT1与山奈酚、杨梅酮、豆甾醇和谷甾醇的亲和能最低（-9.6、-9.3、-11.2、-10.8 kcal/mol），PTGS2与山奈酚、杨梅酮和豆甾醇的亲和能最低（-8.4、-8.6、-8.2 kcal/mol），其对接结果的可视化结果如图 9 所示。

3 结 论

在快节奏的现代生活中，亚健康群体占比攀升，女性月经不调风险随之增加，给身心与社交带来负面影响，发病率上升也威胁着生活质量与整体健康。临床治疗中，激素疗法虽疗效确切，却存在不良反应多、易依赖等弊端，因此，中医学者力推传统中药疗法，且已在临床收获良好成效，探索月经不调新疗法与药物意义重大。临床中，月经不调分型多样：气虚血滞型可见月经提前、经期延长，伴面色?白、畏寒、精神萎靡等[12]；阴虚热型多表现为经量少、经期提前、大便干结、经质稠厚；无排卵型则以激素水平异常为主要特征[13]；无排卵型月经不调，通常表现为激素水平异常[14]。目前，治疗月经不调，中西医结合成为治疗月经不调的优选路径，在四物汤方剂中，当归以补血养肝血、和血而调月经为君药，发挥主导作用；熟地黄以滋补肾阴、补益精血为臣药，辅助君药增强补血之力；白芍药则以养血柔肝、调和营血充任佐药，调和方中药性；川芎则能活血行气、疏畅气血运行，作为使药引导药力直达病所。四味合用，补而不滞，滋而不腻，养血活血，可使宫血调和[15]。

本研究基于网络药理学和分子对接方法，探讨四物汤治疗月经不调的作用机制。通过分析，共筛选出四物汤的20个有效活性成分和113个潜在靶点，并发现这些成分与IL6、TNF、ESR1、AKT1和PTGS2具有较强的结合能力。以下将从核心靶点、活性成分及信号通路三个方面展开讨论。

PPI网络分析表明，IL6、TNF、ESR1、AKT1和PTGS2是四物汤治疗月经不调的核心靶点。在生殖系统中，IL6参与月经的生成[16]，并且IL6 的表达水平会随着月经周期的不同阶段发生相应的规律性变化。TNF与人体的凝血功能相关，TNF的分泌受到月经周期的影响[17]。ESR1 为雌激素主要受体[18]，与月经直接相关。AKT1可促进卵巢细胞的生长、转移等，并能抑制细胞凋亡，其异常活化、过度表达均与卵巢癌的发生发展关系密切，故推测其可影响月经[19]。PTGS2 参与月经的形成过程，在月经来潮前期，子宫内膜腺上皮细胞中 PTGS2 的表达水平升高，进而催化前列腺素合成；这一过程会导致子宫内膜区域血流灌注减少，促使组织发生变性坏死，最终引发月经[20]。

分子对接结果显示，四物汤中的5个成分山奈酚、β-谷甾醇、杨梅酮、豆甾醇、谷甾醇与核心靶点结合良好。文献检索显示，山奈酚具有阻碍炎症作用、降低氧化应激、控制病毒与细菌生长、调节肿瘤增殖和迁移等作用[21]，同时山奈酚可能因抑制PI3K/Akt信号通路磷酸化，从而达到抑制作用，减少癌细胞的增殖、侵袭、迁移数[22]。β-谷甾醇可通过下调Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、1L-1受体关联激酶1（1L-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）的表达，抑制炎症信号通路关键分子的活化，减少分泌IL-6、TNF-a等炎性因子，起到抗炎作用[23]。豆甾醇是一种口服有效、能够穿过血脑屏障、具有抗炎和神经保护作用的免疫调节剂，可以通过 TLR4/NF-kB通路调节小胶质细胞 M1/M2 极化，从而减轻神经性疼痛[24]。豆甾醇可用于神经退行性疾病、炎症性疾病以及疼痛管理等。卵巢囊肿患者体内的炎症因子TNF-α是引发月经不调疾病的内在因素之一，影响着子宫膜的厚度，严重时能产生子宫内膜黏连[25]。

根据 KEGG 富集分析，四物汤有效成分治疗月经不调可作用多条通路，“卵巢类固醇生成” 通路和“雌激素信号通路”通路在治疗月经不调发挥重要作用。卵巢通过卵巢类固醇生成通路合成雌激素（如雌二醇）、孕激素等甾体激素，高浓度雌激素通过正反馈促进排卵，而孕激素联合雌激素负反馈抑制下丘脑GnRH释放，维持月经周期稳态[26]。雌激素信号通路是调控女性生殖发育、代谢稳态及多种器官功能的核心分子网络，其失调与月经紊乱、乳腺癌、骨质疏松等疾病密切相关。在正常月经周期中，雌激素主导卵泡期，促使子宫内膜增生；孕激素在黄体期升高，使增生的子宫内膜向分泌期转化，若该通路异常，激素合成紊乱，会破坏月经周期的激素平衡基础，引发月经不调[27]。

四物汤中的山奈酚、β-谷甾醇、杨梅酮、豆甾醇、谷甾醇等多种活性成分共同作用于IL6、TNF、ESR1、AKT1等关键靶点成分，从而实现对月经不调的治疗效果。研究结果为四物汤的临床应用奠定了基础，同时也为后续深入探究其作用机制与疗效提供了方向线索。