类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症为主要病理特征[1]。研究表明，在患者病变关节滑膜区有大量的经典激活型（M1）巨噬细胞分泌促炎因子和趋化因子诱导关节炎症反应[2]。RA严重影响患者的日常生活和工作[3]。桂枝麻黄附子细辛汤来源于《金匮要略》[4]，可用于治疗寒湿痹阻型的RA。由附子、麻黄、桂枝、细辛、大枣、甘草、生姜组成。桂枝麻黄附子细辛汤具有良好的治疗RA的作用。《金匮要略》中指出，本方以桂枝配伍麻黄，取其辛温发汗、宣散水气之效；附子温经助阳，与细辛合用，共奏祛寒化饮之功。佐以生姜、大枣，既能协同麻黄宣散水气，又能配合桂枝温通营卫；佐以甘草调和诸药。现代药理学研究发现，附子具有抗炎、镇痛作用，可调节免疫（如抑制TNF-α、IL-6等炎性因子）[5]，减轻关节滑膜炎症，适用于寒湿痹阻型关节炎；桂枝中的桂皮醛可扩张血管，改善微循环，缓解疼痛[6]；麻黄中的麻黄碱可兴奋中枢神经，缓解疼痛[7]；细辛挥发油具有抗炎、镇痛作用[8]；而甘草中的甘草酸苷具有免疫抑制作用[9]，由此推测，全方可能通过多途径调节机体免疫功能，协同缓解自身免疫性关节损伤。本研究采用网络药理学及分子对接方法探究桂枝麻黄附子细辛汤抗RA活性成分及作用靶点，揭示桂枝麻黄附子细辛汤治疗RA的相关信号通路及作用机制。

1 实验部分

1.1 药物活性成分及靶点收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis PlatformLab of Systems Pharmacology，TCMSP）（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索麻黄、大枣、甘草等 7 味中药的活性成分，按口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18 筛选[10]，经通用蛋白质资源库（Universal Protein Resource，UniProt ）（https://www.uniprot.org/）将靶点蛋白转换为标准基因名。

1.2 RA靶点筛选

以“Rheumatoid arthritis”为关键词，从基因卡片数据库（GeneCards）（https://www.genecards.org/）和药物与药物靶点综合数据库（DrugBank）（https://go.drugbank.com/）获取 RA 相关靶点[11]，经 UniProt 数据库标准化（限定人源），按相关性评分≥10 筛选后整合去重。

1.3 共同靶点预测

采用 Venny 2.1.0 平台（https://www.genecards.org/）分析方剂成分靶点与 RA 疾病靶点的交集，确定潜在治疗靶点。

1.4 药物-成分-靶点网络构建

基于交集靶点，利用 Cytoscape 3.10.3 构建网络，通过 Network Analyzer 插件筛选核心活性成分[12]。

1.5 PPI网络构建与核心靶点筛选

将交集靶点导入注释、可视化和综合发现数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://string-db.org/cgi/input.pl），选择物种为“人源”，置信度阈值设为≤0.95。导出数据后用 Cytoscape 3.10.3 构建 PPI 网络，通过拓扑分析按度值筛选核心靶点。

1.6 通路富集分析

将治疗靶点导入注释、可视化和综合发现数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID数据库）（https://david.ncifcrf.gov/），进行基因本体说（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析[13]，以 P<0.05 筛选结果并对排名靠前的条目可视化。

1.7 分子对接验证

选取前 6 位核心靶点与关键活性成分对接。从蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB 数据库） （https：//www.rcsb.org/）选择物种为“人源”，获取“X-RAY DIFFRACTION”解析的蛋白结构，经 PyMOL 预处理[14]；从TCMSP 下载成分结构，用 AutoDockTools 转换格式后，通过 AutoDockVina 进行对接，用Discovery Studio 可视化。以亲和力大小评价结合活性（亲和力<-5.0 kcal·mol 为较佳，亲和力<-7.0 kcal·mol为较强）。

2 结果与讨论

2.1 药物成分及靶点筛选

根据生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18获得有效成分，其中大枣有效成分3个，附子有效成分5个，甘草有效成分82个，桂枝有效成分6个，麻黄有效成分14个，生姜有效成分4个，细辛10个。通过TCMSP、PubChem、SwissTargetrediction数据库预测，去除重复后剩余241个靶点。

2.2 疾病靶点筛选

从GeneCards 数据库和drunkbank数据库获取RA靶点，合并去重后筛选出类风湿性关节炎靶点6 629个。桂枝麻黄附子细辛汤治疗类风湿性关节炎交集靶点见图1。

2.3 药物-活性成分-靶点网络

桂枝麻黄附子细辛汤治疗类风湿性关节炎药物-活性成分-靶点网络见图2，包含279个节点、1 255条边，度值前18位活性成分见表1。

2.4 蛋白相互作用网络与核心靶点

桂枝麻黄附子细辛汤治疗类RA PPI网络见图3，包括节点149个、 边561条、平均度值为4.96。桂枝麻黄附子细辛汤治疗类风湿性关节炎核心靶点网络见图4，包含节点142个，557条边。

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析

GO功能富集分析得到生物过程（biological process，BP）5 127个,涉及细胞对氧化应激、氮化合物、脂质、细胞因子刺激的反应、细胞迁移的正向调控、细胞群体增殖等；细胞组分（cellular component，CC）487个，涉及转录调节复合体、膜的侧面、膜泡结构、受体复合物、细胞质的核周区域、细胞的顶端部分(极化细胞中远离基部、形成尖端的特定结构区域，负责物质转运和信号接收)、核膜、囊泡腔、细胞外基质；分子功能（molecular function，MF）899个，涉及、转录因子结合、氧化还原酶活性、磷酸酶结合等。见图5。

KEGG通路富集分析得到197条通路，选择P值前20位条目见图6，涉及糖尿病性心肌病、MAPK信号通路、IL-17信号通路等。由图6可知，桂枝麻黄附子细辛汤治疗RA的关键通路可能与炎症、癌症等相关通路密切相关。

2.6 分子对接结果

将药物-活性成分-靶点网络筛选出的活性成分槲皮素、叶黄素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、甘草查尔酮 a、7-甲氧基-2-甲基异黄酮分别与PPI网络度值前6位靶点进行分子对接，结合能见表2。将结合能力较强的ESR1与活性成分进行可视化展示，见图7。

3 结论与讨论

3.1 PPI网络对该汤剂治疗相关核心靶点的分析

PPI网络分析结果显示，排名前6位的靶点依次为TP53、TNF、AKT1、STAT3、ESR1、HSP90AA1，推测其可能是该药治疗类RA的核心靶点。在RA患者的滑膜成纤维细胞（FLS）中，TP53常呈现“低表达或突变失活”状态，这一异常会导致FLS增殖失控、抗凋亡能力增强，进而形成具有侵袭性的滑膜组织，并大量分泌MMP-1、MMP-3等基质金属蛋白酶，最终加速关节软骨的降解[15]。已有文献报道，TP53可通过抑制炎症因子的产生发挥RA治疗作用，而TP53功能缺陷在RA的发病机制中扮演着关键角色[16-17]。此外，该汤剂可能通过上调TP53表达发挥双重治疗效应：一方面通过激活p53/p21通路阻滞FLS的异常增殖，另一方面通过促进促凋亡蛋白Bax的表达，诱导过度活化的FLS凋亡；同时，TP53可通过结合炎症因子启动子区域的p53结合位点，抑制IL-6、TNF-α等炎症因子的转录[18]，从而实现抑制滑膜侵袭与平衡炎症反应的双重功效。

此外，TNF与STAT3均参与机体炎症反应调控：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是RA发病机制中的关键细胞因子[19]，其过量产生是RA重要的致病因素，在协调炎症免疫反应中发挥核心作用。RA患者体内会产生大量炎症因子，目前已有TNF-α抑制剂应用于RA治疗的临床实例[20]。

在免疫方面，STAT3被IL-6、IL-17等细胞因子激活后进入细胞核，可促进Th17细胞分化并抑制Treg细胞功能，进一步加剧机体免疫失衡[21]；在骨代谢层面，核内STAT3可直接结合破骨细胞分化相关基因的启动子，促进破骨细胞活化，加重骨损伤[22]。

分子对接结果显示，山奈酚可与STAT3的DNA结合域结合（结合能为-8.0 kcal/mol），推测其可能通过阻止STAT3与靶基因启动子结合、抑制STAT3二聚化的方式，同时改善RA患者的免疫紊乱与骨侵蚀，这与KEGG富集分析中“IL-17信号通路”的调控作用相吻合。

3.2 GO功能结果分析的结果分析

GO功能富集分析结果显示，BP基因显著富集于炎症反应、氧化应激调控及细胞增殖与迁移，提示该汤剂可能通过抑制炎症因子过量产生、减轻氧化损伤，并调控免疫细胞增殖与浸润，从而缓解RA的关节破坏。该汤剂可能通过抑制TNF-α/IL-6/IL-17介导的信号通路，减少巨噬细胞向滑膜组织的募集，同时抑制中性粒细胞的趋化与活化，进而减轻滑膜组织的慢性炎症浸润[23]。

此外，该方剂并非完全抑制机体免疫功能，而是通过上调IL-10、TGF-β等抗炎因子，恢复机体“促炎-抗炎”平衡，避免因过度抑制免疫而引发的感染风险，这与中医药“扶正祛邪”的治疗原则高度一致。

CC功能主要富集于膜受体复合物、核调控结构及囊泡运输，表明该方剂的作用可能与细胞信号转导、核内基因转录调控及细胞外基质重塑密切相关。其中，“膜受体复合物”对应RA中TLR4、TNFR1、IL-6R等炎症受体，方剂中的活性成分（如槲皮素）可与这些受体结合，抑制其与配体（LPS、TNF-α、IL-6）的相互作用，从而阻断下游信号通路的启动；“核调控结构”（如核小体、转录因子复合物）对应NF-κB、STAT3、p53等转录因子的核转位及靶基因结合过程，山奈酚、柚皮素等成分可通过抑制这些转录因子的核转位，或阻止其与DNA结合，进而调控促炎基因的表达；“囊泡运输”对应炎症因子的分泌过程，推测该方剂可能通过调控囊泡的形成与释放，减少炎症因子的胞外分泌[24]。

分子功能（MF）功能关键涉及蛋白激酶活性（如MAPK信号通路中的相关激酶）、转录因子结合（如STAT3、NF-κB）及氧化还原酶活性，这进一步证实桂枝麻黄附子细辛汤可通过抑制促炎信号通路（如IL-17、MAPK通路）及抗氧化应激，发挥RA治疗作用。

3.3 KEGG通路富集分析的结果与讨论

KEGG通路富集分析结果显示，该汤剂治疗RA的关键作用通路分别为癌症相关通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等。其中，MAPK通路的调控机制如下：TNF-α、IL-17等炎症因子可激活MAPK通路的p38、ERK1/2、JNK三个分支，分别调控炎症因子转录、FLS增殖及FLS凋亡抵抗；该方剂中的槲皮素、山奈酚可抑制p38与ERK1/2的磷酸化[25]，汉黄芩素可抑制JNK活性，从而实现对MAPK通路全分支的协同调控。

Th17细胞分泌的IL-17可通过激活NF-κB、MAPK通路，促进炎症因子及MMPs的分泌，并通过RANKL诱导骨破坏；该方剂可通过抑制STAT3表达减少Th17细胞分化，同时山奈酚可阻断IL-17与IL-17RA的结合，从通路上下游双环节实现阻断调控。

TNF信号通路作为RA炎症反应的启动通路，其激活后可进一步启动NF-κB、MAPK、PI3K/AKT等下游通路；该方剂通过槲皮素抑制TNF-α活性，汉黄芩素阻断TNFR1二聚化，并抑制AKT1/NF-κB等下游通路的激活，实现对TNF信号通路多节点的干预调控。

3.4 分子对接结果的分析与讨论

分子对接结果显示，该汤剂中关键活性成分（槲皮素、叶黄素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮）与RA核心蛋白靶点（ESR1、TNF、AKT1、HSP90AA1、STAT3）均具有良好的结合活性，仅甘草查尔酮A与所有靶点的结合能力较弱；其中，ESR1与上述7种活性成分均表现出较好的结合活性，且柚皮素与ESR1的结合能最低（-8.6 kcal/mol），提示柚皮素与ESR1的结合可能在RA治疗中发挥关键作用。

槲皮素、山奈酚来源于方剂中的麻黄和甘草。其中槲皮素具有抗氧化、抗炎等药理作用，其可通过减少炎性细胞因子及介质释放、减轻氧化应激、抑制FLS增殖、迁移与侵袭、促进FLS凋亡，同时调节Th17/Treg细胞失衡及Th17细胞分化以调控自身免疫反应，从而缓解RA症状[26]。

山奈酚具有抗炎、抗菌、抗氧化及神经保护作用，在RA治疗中表现出显著疗效，其可能通过调控NLRP3/CASP1/GSDMD轴及T细胞活化发挥抗炎作用，进而保护软骨细胞[27]。

柚皮素来源于甘草，具有抗癌、神经保护、抗炎、抗氧化及减轻组织损伤的药理作用，研究显示其可通过抑制神经元CRMP2磷酸化，逆转脊髓致敏并改善关节炎疼痛[28]。甘草查尔酮A结合活性较弱，推测其可能发挥辅助作用，与其他成分协同抑制炎症反应 [29]。

综上所述，该汤剂可通过山奈酚、槲皮素、柚皮素等活性成分，作用于TP53、TNF、AKT1、STAT3、ESR1、HSP90AA1等核心靶点，从炎症调控、免疫平衡、抗氧化应激、关节保护等综合干预RA，发挥多成分，多作用多靶点综合作用。未来需进一步开展临床试验验证其临床疗效，并深入探索方剂中各成分的精准配伍优化方案。