β-内酰胺类抗生素是临床抗感染药物的重要组成部分，其关键母核6-氨基青霉烷酸（6-APA）及相关半合成抗生素的绿色制备长期依赖微生物来源青霉素酰化酶（penicillin G acylase，PGA）催化体系。与传统化学法相比，PGA催化过程具有反应条件温和、区域及立体选择性高、环境负担较低等优点，因此在医药中间体制造和手性化合物拆分领域具有重要应用价值[1-4]。然而，天然PGA作为可溶性蛋白，在高底物浓度、复杂缓冲体系、连续反应和多批次循环使用中容易出现构象变化、活性下降和分离回收困难等难题，直接限制其工业经济性。

固定化技术的核心并非酶的简单负载，而是通过载体孔径、亲疏水性、电荷分布、表面反应基团和固定化方式的协同调控，使PGA在保持活性中心可及性的同时获得更强的构象稳定性和更长的操作寿命[5-6]。合理设计的载体不仅可提高PGA在温度和pH波动下的稳定性，还可支撑磁分离回收、固定床连续运行及多酶级联等工程化应用[7-10]。

固定化酶的一般方法已有较多报道，PGA催化反应体系也积累了丰富数据，但不同载体如何匹配PGA结构特征、表面修饰如何影响固定化取向与传质、实验室性能指标如何转化为工业评价标准，仍缺乏面向载体构建的系统梳理。基于此，本文以微生物来源PGA为对象，围绕载体构建、表面功能化、固定化策略和性能评价展开综述，并结合近年来磁性纳米载体、乙烯砜琼脂糖载体、锆基金属-有机框架（zirconium?based metal?organic frameworks，Zr-MOFs）及连续流反应器研究进展，归纳PGA固定化载体从材料设计走向连续化生产应用所需解决的关键问题。

1 PGA结构特征与固定化设计原则

1.1 微生物来源PGA的酶学特征

PGA广泛来源于细菌、真菌和放线菌等微生物，其关键功能是依靠活性中心氨基酸残基与底物形成特定结合形式，促使青霉素类及头孢类抗生素前体发生酰化或去酰化反应。大肠杆菌来源PGA应用最为广泛，其成熟酶通常由α、β两个亚基组成，催化中心位于β亚基N端丝氨酸附近，底物进入活性口袋后发生酰基转移或去酰化反应[1]。PGA空间结构对环境敏感，活性中心三维结构完整状况直接决定催化活性，多数PGA有明确最适温度范围（25~40 ℃）及最适pH范围（6.0~8.0），超出此范围易引发构象变化致酶失活。固定化时若载体表面过强吸附或孔径不匹配，可能造成活性口袋遮挡、底物扩散受限或蛋白构象扰动。因此，保证酶分子稳定固定并减少流失，保留活性中心附近的柔性和底物可及性，满足工业反应中分离回收、长期循环、固定床装填及成本控制是PGA固定化载体设计时需要兼顾的三类问题[2-4]。

1.2 固定化载体的关键设计参数

适用于PGA的载体通常需要具备良好的水相稳定性、生物相容性、可修饰表面和适宜的孔结构。孔径过小会产生空间阻隔并降低表观反应速率，孔径过大又可能导致酶分子结合不牢或局部浓度不足。对于约80 kDa量级的PGA，介孔或大孔结构更利于底物传输和酶分子进入。除孔结构外，载体表面的羟基、氨基、环氧基、醛基、羧基、乙烯砜基等功能团决定了酶与载体之间的结合方式及固定化后的微环境[5-10]。从结构与性能关系看，亲水表面有利于维持PGA天然水化层，降低非特异性疏水吸附导致的失活。适度疏水或带电结构则可帮助调控酶取向，提高后续共价反应效率。磁性载体便于快速回收，MOFs等多孔晶体材料可通过孔道和配体工程调控微环境，但也需要关注金属离子泄漏、孔道扩散和制备成本。

1.3 固定化策略及作用机制

固定化策略包括物理法和化学法，主要差别体现在酶与载体相互作用方式。物理法含物理吸附法和包埋法，物理吸附法凭载体表面范德华力、氢键等非共价作用固定酶，操作温和且能保持酶原结构，包埋法通过多孔载体空间限制作用包裹酶分子以避免外部环境干扰[11-13]。化学法含共价结合法和交联法，共价结合法运用载体表面功能基团与酶分子氨基酸残基形成稳固共价键以提高结合强度，交联法借助交联剂引导酶分子间或酶与载体间交联聚合增强酶结构稳定性。选择策略需契合PGA结构特点及应用场景，在活性保留和稳定性需求间找到平衡[14-15]（图1）。

因此，评价固定化PGA不能停留在“是否固定成功”层面，而应建立包含酶学性能、应用性能和环境适应性的多维指标体系。酶学性能主要包括固定化率、酶活回收率、Km、vmax和kcat/Km；应用性能关注载体负载量、重复使用次数、固定床运行周期和空间时间产率；环境适应性则考察热稳定性、pH稳定性、有机相/盐耐受性及抗底物或产物抑制能力。该体系可为不同载体和不同固定化策略的横向比较提供相对客观的依据[16-20]。

2 PGA固定化载体类型及结构

2.1 有机高分子与天然载体

有机高分子与天然载体的设计重点在于“结构—功能适配性”，即在亲水微环境、功能基团密度和机械强度之间取得平衡。环氧树脂、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球、聚丙烯酰胺/水凝胶、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸盐和纤维素衍生物等均可通过环氧基、醛基、氨基或乙烯砜基实现PGA固定化[21-22]。与无机材料相比，这类载体通常更有利于维持蛋白水化层和活性构象，但在长期循环、抗溶胀和固定床机械强度方面需要进一步优化[7,23-24]。乙烯砜琼脂糖研究表明，离子强度和封闭步骤会显著影响PGA初始吸附、取向和后续多点共价反应，提示固定化条件本身也是载体性能的重要组成部分[25-28]。

天然高分子载体具有来源广、生物相容性好和亲水性强等优点，可降低非特异性疏水吸附造成的失活。壳聚糖、琼脂糖和纤维素经戊二醛活化、环氧化或羧基化处理后，可增强酶—载体结合稳定性；若进一步引入磁性组分，则可兼具亲水微环境和快速回收优势。不过，天然载体孔结构分布较宽、机械强度有限，放大应用时需重点考察压降、溶胀和批间一致性。已有壳聚糖微珠、甘露聚糖修饰PGA及聚丙烯酸载体研究，可为低成本亲水载体的结构优化提供参考[29-31]。

2.2 无机与磁性纳米载体

无机与磁性纳米载体的优势主要体现在高比表面积、良好机械稳定性和可控表面修饰能力。二氧化硅、介孔硅、TiO2、氧化铝、Fe3O4及多金属铁氧体等材料表面通常含有羟基或硅羟基，可经硅烷化、氨基化、醛基化或环氧化引入反应位点。对于分子量约80 kDa、分子尺寸约5~10 nm的PGA，介孔或大孔结构更有利于底物进入和产物扩散；孔径过窄易造成空间阻隔，孔径过宽则可能降低酶分子固定稳定性。

磁性载体尤其适合PGA批次循环和连续反应后的快速回收。以功能化Ni0.4Cu0.5Zn0.1Fe2O4磁性纳米颗粒为例，研究者通过快速燃烧法制备磁性铁氧体，再经SiO2包覆和戊二醛醛基化构建“磁性核心—SiO2壳层—醛基位点—PGA”的层级结构，从而实现PGA共价固定[10,32-34]。该体系使固定化PGA最适温度提高至50 ℃，但vmax下降、Km升高，说明共价固定和壳层保护提高稳定性的同时，也引入了扩散阻力和空间位阻。循环使用5次后仍保留25%以上活性，体现了磁分离载体的回收优势；但颗粒聚集、醛基密度过高和酶取向不合理仍是限制催化效率的主要因素。

2.3 MOFs载体

MOFs由金属节点和有机配体构成，具有孔径可调、比表面积高、配体可功能化和微环境可设计等特点[35-37]。对于PGA，MOFs的价值不仅在于“包埋保护”，更在于通过孔道限域、金属节点和配体功能基团调控酶周围微环境，从而影响酶取向、稳定性和底物可及性。2025年报道的Zr-MOFs动态交换策略将PGA固定于锆基MOFs中，所得PGA@Zr-MOFs在保持61%~85%游离酶活性的同时表现出良好稳定性，并可作为固定床填料完成50个循环操作[11]。该研究还提出水相和球磨等更具成本优势的合成路线，说明MOFs若要走向PGA工业固定化，需要同步解决水相稳定性、孔径匹配、金属离子影响、规模化制备和固定床适配问题。

以前沿趋势看，MOFs固定化酶研究正在由单一保护载体向层级孔结构、磁性复合MOFs、多酶级联和连续流适配方向发展[35-37]。连续流MOF合成可提高反应参数控制、批间重现性和放大效率，为制备粒径均一、孔结构稳定的酶固定化载体提供新路径。对于PGA，后续研究应优先关注大孔/介孔MOFs、磁性MOF复合物和可成型MOF颗粒，以兼顾酶负载、传质、固定床压降和长期运行稳定性。

2.4 传统经典载体

传统经典载体的优势在于成本低、工艺成熟和放大基础较好。琼脂糖、硅藻土、氧化铝、离子交换树脂和商业环氧树脂等材料虽然在孔结构和表面微环境精细调控方面不及新型纳米材料或MOFs，但其批间稳定性、法规接受度、清洗再生和固定床装填经验更接近实际生产需求。对于PGA工业化而言，载体的机械强度、压降、装填密度、长期运行稳定性和成本核算往往与实验室酶活数据同等重要。因此，传统载体仍是评价新型固定化材料工业可行性的参照体系。

载体结构与修饰方式的典型案例详见表1。

3 表面修饰与协同固定化策略

3.1 功能基团调控

载体表面修饰是连接材料结构与酶学性能的关键环节。氨基、羧基和羟基等可调节表面电荷与亲水性，帮助PGA形成温和吸附微环境；醛基、环氧基和乙烯砜基等可与PGA表面的赖氨酸、组氨酸、酪氨酸或巯基等残基发生共价反应，提高固定化稳定性[5,7,23,25-28]。需要强调的是，功能基团密度并非越高越好，过高的反应位点可能导致过度多点结合，使酶分子柔性下降或活性口袋受限。

优化表面修饰时，应重点关注三个方面：一是反应基团密度，使固定化效率与活性保持之间达到平衡；二是间隔臂长度，避免载体表面空间位阻直接影响PGA活性中心；三是表面亲水/疏水微环境，使PGA在固定化后仍维持适宜水化层。

3.2 多点共价固定化与取向控制

多点共价固定化可通过多个酶—载体键限制PGA整体构象波动，是提升热稳定性和耐有机溶剂能力的重要策略[2,5,23]。然而，多点固定化效果取决于酶在载体表面的初始取向。如果PGA以活性中心附近区域贴附载体，可能出现较高负载量但较低表观活性。因此，理想策略是先利用适度静电或疏水作用诱导有利取向，再通过共价反应锁定结构。

乙烯砜琼脂糖固定化PGA的研究表明，高离子强度可增强初始吸附并促进后续共价反应，说明固定化体系中的盐浓度、pH、保护剂和封闭剂均会影响最终酶制剂性能[7]。这一规律提示，在进行载体比较时，不能只比较材料本身，还必须同时考察固定化条件与后处理步骤。

3.3 微环境优化与复合载体

复合载体可叠加不同材料优势，例如以磁性核提供快速回收能力，以SiO2或聚合物壳层提供可修饰表面，以亲水高分子链、多酚层或环糊精结构改善酶周围微环境。对PGA而言，亲水保护层可降低蛋白失水和非特异性吸附，带电基团可调节局部pH和底物富集，大孔/介孔层次结构可改善底物扩散。聚多巴胺、多酚层及β-环糊精/金属离子复合修饰等策略显示出改善PGA稳定性和重复使用性的潜力[24,33-34]。

但复合载体复杂度增加也会带来批间差异、成本上升和质量控制难题。工业放大时，应优先选择制备路线简单、原料来源稳定、关键参数可在线监测的复合载体体系，并将载体可再生性、固定床压降和长期连续运行稳定性纳入评价（图2）。

4 固定化PGA性能评价体系

固定化PGA性能不能仅以固定化率或负载量评价。高负载量可能伴随底物扩散受限或活性位点遮蔽，导致实际催化效率下降。更合理的评价体系应同时包括酶学性能、应用性能、传质/机械性能和绿色经济性（图3，表2）。

已有研究显示，磁性Ni0.4Cu0.5Zn0.1Fe2O4固定化PGA可提高最适温度和温度/pH稳定性，但重复使用后仍存在活性衰减，说明磁分离优势并不等同于长期工业稳定性[10]。Zr-MOFs动态交换体系在固定床50次循环中保持较高活性，为连续化评价提供了更接近工业应用的证据[11]。连续流生物催化研究进一步表明，固定化酶反应器的性能取决于载体孔径、酶取向、装填方式、停留时间、压降和空间时间产率等因素[38-40]。因此，未来PGA固定化研究应减少单一静态酶活数据，增加连续反应、长期储存、真实底物体系、载体再生和过程经济性评价。

5 结论与展望

微生物来源PGA固定化载体构建的本质，是在PGA结构敏感性、载体可设计性和工业反应需求之间建立平衡。传统有机高分子和天然载体具有成本和工艺成熟优势，无机及磁性纳米载体突出分离回收和机械稳定性，MOFs则在孔道限域和微环境调控方面展现出新潜力。表面修饰和多点固定化能够提升PGA稳定性，但过度结合、孔径不匹配和取向失控可能导致活性损失。未来研究应进一步从材料性能展示转向结构导向设计、连续化验证和经济性评价，并以真实底物体系、固定床运行和载体再生为核心指标，推动固定化PGA在β-内酰胺类抗生素绿色制造中的高效、稳定和低成本应用。

未来PGA固定化研究应由单纯提高酶活保持率，转向载体设计、固定化策略与工业应用协同优化。在载体方面，应重点发展磁性纳米材料、介孔硅、MOFs及天然高分子复合材料，通过调控孔径结构、表面电荷、亲疏水性和功能基团密度，改善酶分子负载状态并降低传质阻力。与此同时，载体设计应从“材料性能展示”转向“反应器适配”，重点关注固定床填料强度、压降、抗剪切能力、清洗再生和规模化制备成本，建立载体结构与固定化性能之间的构效关系。

在固定化策略方面，未来应更加重视酶分子的取向控制与微环境优化。多点共价固定化、定向固定化、温和交联和仿生微环境构建可提高酶—载体结合稳定性，但也应避免活性中心受阻和扩散限制。工业应用方面，应加强固定化PGA在固定床反应器、膜反应器和连续流体系中的研究，系统评价长期运行稳定性、空间时间产率、底物/产物抑制、载体再生及放大成本[41-44]。同时，应建立统一评价标准，促进不同研究成果的横向比较，推动PGA固定化技术向连续化、规模化和经济化应用发展。