《武汉工程大学学报》 2020年02期
143-152
出版日期：2021-01-26
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
γ-聚谷氨酸的发酵优化及其对辣椒生长的影响
γ-聚谷氨酸（γ-poly-glutamicacid， γ-PGA）是一种天然阴离子生物多肽，分子量为1万~2万，其通常由L-谷氨酸（L-Glu）和D-谷氨酸（D-Glu）通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键连接而成［1-3］。γ-PGA具有极佳的水溶性、生物亲和性和生物降解性，其吸附性也十分优异，其可作为药物增效剂、癌症靶向药载体或基因载体广泛应用于医药行业，其增稠性极佳可作为食品工业中的增稠剂、营养助剂和风味添加剂，除此也广泛应用于化妆品研制、污水吸附处理、重金属土壤治理等诸多方面［4-6］。在农业方面，亦可作为肥料增效剂、缓释剂和稳定剂，更可保持土壤水分同时吸附土壤中的阳离子来增强耕作土壤肥力，能有效改善土壤团粒结构促进农作物生长，提高农作物的抗逆性［7-9］。γ-PGA最早发现于炭疽芽孢杆菌中，Troy等［10］发现它是一种易溶于水的酰胺类化合物，可通过芽孢杆菌及其变种的次级代谢产物中获取。目前生产 γ-PGA常用的方法有化学法、酶转化法、物理提取法和微生物发酵法，其中微生物发酵法因其生产条件简单、周期短、产量大、目标产物分子量适宜应用最为普遍。但由于 γ-PGA的产出率低且缺乏低廉的提取工艺等原因，导致 γ-PGA产量偏低，严重影响了 γ-PGA在我国的大规模应用。近年来采用基因工程改造菌株和响应面优化培养基使得 γ-PGA的产量逐年提高［11］。王增等［12］利用基因组重组技术由枯草芽孢杆菌GXA-28出发获得了突变株F3-178，其突变菌株中 γ-PGA相关合成基因的过度表达使得 γ-PGA产量提高了1.9倍［（34.3±1.2） g/L］，发现基因组重组技术可用于快速改良 γ-PGA产生菌株并有效提高目标产物产量。曹小红［13］等利用Plackett-Burman设计和响应面分析 Box-Behnken设计法对产 γ-PGA发酵培养基进行了优化，通过显著因素筛选和多元二次回归方程拟合三个显著因素与 γ-PGA产量之间的函数关系对回归方程进行分析后获得最优工艺参数，在优化后的培养基下 γ-PGA的产量比优化前提高了34.01%。鉴于化肥过度使用造成的众多环境问题，我国农业实践正朝着开发环境友好型氮肥方向转变。γ-PGA对土壤微生物群落和作物氮素吸收具有良好的促进作用，γ-PGA可明显提高化肥利用率，将 γ-PGA 添加到化肥中施用，可减少化肥施用量20%，减少化肥施用对环境的压力［14］。此外，γ-PGA 及其增效肥与同类聚丙烯酸、聚天冬氨酸等目前已经大量开发的肥料促进剂相比，其在具备减缓施用肥料流失、抗旱保墒、抗病增产等功效的同时，兼具成本低、使用便捷等优势［15］。褚群等［15］研究发现 γ-PGA对培养基质的理化性状和番茄生长均有促进作用，施用后显著提高基质的持水孔隙度、最大持水量、铵态氮、硝态氮、速效磷、速效钾、交换性镁含量，降低培养介质EC值、通气孔隙大小和pH值，促进了番茄穴盘苗生长发育后期基质中过氧化氢酶活和中性磷酸酶活，且作用效应随着添加量的增高而显著增强。Jiang等［16］也发现采用 γ-PGA包被尿素可以有效减缓尿素的溶解，与未经处理的尿素相比利用其制备的3种 γ-PGA尿素复合肥均可使花期的番茄叶绿素含量增加100%，且土壤分析结果表明施用复合肥后的盆栽土壤中铵态氮含量比尿素处理后的盆栽土壤高25%～61%，而番茄收获后，硝态氮含量低近50%，证明 γ-PGA尿素复合肥能促进作物对氮的吸收，减少了施氮量的损失。除对番茄，γ-PGA及其所制备的复合肥均对辣椒、小白菜［17］、甘蓝、水稻［18］、柑橘［19］等作物的生产都有促进作用，但相关研究以土壤施用居多叶面喷施的研究较少［20-21］。本实验通过响应面法对实验室分离提取的一株高产γ-PGA枯草芽孢杆菌进行发酵优化以提高γ-PGA的产量、降低生产成本，然后对发酵产物进行分离提纯与尿素复配制备复合叶面肥，研究其喷施后对于辣椒幼苗表观形态和生理指标以及成株产量的影响，以期为 γ-PGA叶面肥的研制和施用提供基础。1 实验部分1.1 材 料菌种：高产 γ-PGA枯草芽孢杆菌由实验室分离保存。试剂：酵母粉、琼脂、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、黄豆粉、玉米浆、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、淀粉、纤维素、丙三醇（甘油）、L-谷氨酸、L-谷氨酸钠、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3、NH4NO3、NaNO3、尿素、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide ，CTAB），以上试剂均为分析纯。γ-PGA（70 kD）标准品（国药集团化学试剂有限公司）。1.2 培养基斜面培养基： 胰蛋白胨10.0 g/L、 酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、明胶18.0~25.0 g/L，将pH调至7.0～7.2，于高压灭菌锅121 ℃ 灭菌20 min。种子培养基： 胰蛋白胨10.0 g/L、 酵母浸粉5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L以及蔗糖1.0 g/L，将pH调至7.0～7.2，于高压灭菌锅121 ℃ 灭菌20 min。基础发酵培养基：L-谷氨酸钠25.0 g/L、柠檬酸钠 16.8 g/L、蔗糖20.0 g/L、NH4Cl 7.0 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl2 0.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，将pH调至7.0～7.2，于高压灭菌锅121 ℃ 灭菌 20 min。1.3 方 法1.3.1 培养方法 菌种活化：由实验室-20 ℃保藏菌种的冷冻甘油管中取1环菌种接入斜面培养基中，37 ℃培养24 h，革兰氏染色镜检无误后用作活化菌种。种子培养：取1环活化后单菌落中的菌体接种于种子培养基（250 mL三角瓶装液量为50 mL），200 r/min，37 ℃，恒温振荡培养12 h。摇瓶发酵：加入250 mL三角瓶装发酵培养基50 mL，种子液以质量分数3%的接种量接入发酵培养基中，200 r/min，37 ℃，恒温震荡培养72 h。1.3.2 发酵液中 γ-PGA的检测 利用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶液与γ-PGA反应可产生浑浊的特性，通过酶标仪测定反应体系的250 nm吸光度来反映其浊度，进而通过浊度与γ-PGA标准品的浓度线性方程y=0.033 5x-0.151 9计算发酵液中 γ-PGA的含量，可快速准确地测定发酵液中 γ-PGA的含量［22］。1.3.3 发酵培养基的优化 单因素试验：探究以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素作为单一碳源时γ-PGA的产量，确定最佳碳源后进行爬坡实验。以不加氮源的发酵培养基为基础培养基，分别添加6 g/L的酵母膏、黄豆粉、玉米浆、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、尿素、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、硝酸铵、硝酸钠，其他营养成分不变，来探究不同氮源对于 γ-PGA的产量的影响，确定最佳氮源后进行爬坡实验。以发酵培养基为基础，分别添加0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g /L 的L-谷氨酸钠，其他条件相同，探究发酵前体L-谷氨酸钠浓度对 γ-PGA 产量的影响。每组均做10个平行对照重复3次。响应面优化实验：在单因素实验的基础上，选取最佳碳源、最佳氮源及谷氨酸钠三个因素为自变量，以 γ-PGA产量为响应值，利用 Design Expert 8.0 软件设计三因素三水平的响应面实验（表 1）。采用Box-Behnken实验设计来评价各项指标与因素间的非线性关系，实验组合数少、准确经济。逐因子试验法，采用Design Expert 8.0软件进行实验分析和响应面法优化发酵条件。1.3.4 γ-PGA复合叶面肥对辣椒生长及产量的影响 田间小区试验于2018年进行，试验地点位于武汉工程大学流芳校区，试验土壤全氮含量1.23 g/kg，全磷含量12.72 g/kg，全钾含量17.61 g/kg，有机质含量31.98 g/kg，速效磷含量20.39 g/kg，速效钾含量20.72 g/kg，pH 7.25。供试 γ-PGA为实验最佳发酵培养基发酵后所制备纯化所得的 γ-PGA冻干粉剂。试供辣椒（Capsicum annuum L.）品种为薄皮王-3 F1 大果早丰薄皮辣椒（宜昌市比亚久种业有限公司）。田间小区试验于2018年进行，试验辣椒于2月28日采用128孔穴盘进行加温育苗，3月28日定植根系满穴的植株，采用单株定植方式：底肥为有机肥1 800 kg/hm2，以及魔肥150 kg/hm2。试验设7个处理，分别为：1）清水 （CK）；2）10 g/L 尿素稀释液；3）10 g/L 尿素 + 0.2 g/L γ-PGA稀释液；4）10 g/L 尿素 + 0.4 g/L γ-PGA稀释液；5）10 g/L 尿素 + 0.6 g/L γ-PGA稀释液；6）10 g/L 尿素 + 0.8 g/L γ-PGA稀释液；7）10 g/L 尿素 + 1.0 g/L γ-PGA稀释液。尿素与 γ-PGA 复合叶面肥（γ-PGA-compound foliar fertilizer，γ-PGA-SCU） ，每组处理重复3次，每组重复20株，处理间设置保护行各处理田间管理一致，在4月1日进行第一次肥料喷施叶面，以后每隔7 d喷施1次，共喷施叶面肥料液8次。于定植后30 d和60 d时测定辣椒幼苗的表观形态和各项生理指标。每组重复随机取10株幼苗，分别用直尺和游标卡尺测定辣椒株高和茎粗，扫描仪（Scan Maker i800）扫描和LA-S叶面积分析系统测定叶面积，称重法测定茎叶、根鲜物质量和干物质量，壮苗指数=（茎粗/株高） × 全株干重。氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）还原法测定根系活力，叶绿素仪（Chlorophyll meter，SPAD-502Plus）测定最新完全展开叶片的SPAD值，每组重复随机取样10株。试验数据采用DPS 7.05和Excel 2016软件进行统计分析。辣椒果实成熟后， 每组重复随机取10株辣椒苗测定其农艺性状产量 （单果重、单株挂果数、单株产量含量），试验数据采用DPS 7.05和Excel 2016软件进行统计分析。2 结果与讨论2.1 不同碳源对 γ-PGA产量的影响通常以柠檬酸和甘油作为复合碳源来进行 γ-PGA的微生物发酵培养，按原有发酵培养配方 γ-PGA产出率较低。本实验研究以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、纤维素作为单一碳源时 γ-PGA的产量。碳源添加量为30 g/L，其他营养成分不变，结果如表2所示。当发酵培养中不额外添加碳源时，菌体以谷氨酸钠为营养物质生长较差，所产 γ-PGA量少。以蔗糖作为唯一碳源时γ-PGA的产量最高为19.14 g/L，此时菌体生长状况也最好，故选择蔗糖为发酵培养基的最佳碳源。设置不同梯度浓度的蔗糖作为唯一碳源进行爬坡实验，探究不同蔗糖浓度对γ-PGA产量的影响。结果如图1所示，发酵液中 γ-PGA的产量先随着发酵培养基中蔗糖浓度的增加而升高，当蔗糖的添加量为40 g/L时 γ-PGA产量达到峰值，当发酵培养基中蔗糖的浓度超过40 g/L后发酵液中 γ-PGA的产量不再随着蔗糖浓度的增加而升高趋于一个定值。2.2 不同氮源对 γ-PGA产量的影响以发酵培养基为基础培养基，分别添加6 g/L的酵母膏、黄豆粉、玉米浆、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨、尿素、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、硝酸铵、硝酸钠，其他营养成分不变。结果如表3所示，相较于大多数无机氮源有机氮源能更为有效地促进发酵过程中高产 γ-PGA枯草芽孢杆菌的生长，其中采用玉米浆和胰酪蛋白胨为唯一氮源时细菌生长量均达到较高水平，但发酵产物γ-PGA的产量仅黄豆粉作为唯一氮源时较高为19.32 g/L。无机氮源相对于有机氮源价格更为低廉，采用硫酸铵作为唯一氮源时发酵液中细菌生长量较高其目标产物收率也最高为23.91 g/L，综合考虑最佳氮源选择硫酸铵为宜。表2 不同碳源对 γ-PGA合成的影响Tab. 2 Effect of different carbon sources on yeild of γ-PGA[碳源\&细菌生长量（A660）\&γ-多聚谷氨酸质量浓度 / （g/L）\&残留谷氨酸钠质量浓度 / （g/L）\& 无\&0.106\&4.52\&23.49\&葡萄糖\&0.272\&11.02\&12.60\&蔗糖\&0.300\&19.14\&16.96\&甘油\&0.272\&13.74\&15.72\&麦芽糖\&0.290\&18.52\&15.24\&淀粉\&0.202\&13.13\&20.32\&纤维素\&0.145\&6.48\&21.58\&][20 30 40 50 60 70 80Sucrose mass concentration /(g/L)][252015][γ-PGA yield / (g/L)]图 1 蔗糖质量浓度对 γ-PGA产量的影响Fig. 1 Effect of sucrose mass concentration on yeild of γ-PGA 继而选择不同浓度的硫酸铵作为唯一氮源进行发酵，考察不同浓度的硫酸铵对γ-PGA产量的影响。结果如图2所示，发酵液中 γ-PGA的产量随着硫酸铵浓度在一定范围内的增加而升高，当在硫酸铵的添加量为7 g/ 时 γ-PGA产量最高，当发酵培养基中硫酸铵的浓度超过7 g/L后发酵液中 γ-PGA的产量随着硫酸铵浓度的增加而减少。[2321191715][γ-PGA yield / (g/L)][5 6 7 8 9 10Ammonium sulphate mass concentration / (g/L)]图 2 硫酸铵质量浓度对 γ-PGA产量的影响Fig. 2 Effect of ammonium sulphate mass concentration on yeild of γ-PGA2.3 L-谷氨酸钠对 γ-PGA产量的影响以发酵培养基为基础，分别添加0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/L的L-谷氨酸钠，其他条件相同，考察L-谷氨酸钠质量浓度对γ-PGA产量的影响。结果如表 4和图 3所示 ，不同质量浓度的L-谷氨酸钠对 γ-PGA 的发酵生产有很大影响，当谷氨酸钠质量浓度为10~80 g/L 时 γ-PGA的产量随L-谷氨酸钠质量浓度升高而迅速地升高，当超过了80 g/L时产量增速放缓，在添加量为80 g/L时 γ-PGA产量最高为63.57 g/L。当L-谷氨酸钠质量浓度为80~120 g/L时 γ-PGA的产量随着 L-谷氨酸钠质量浓度升高而下降，过高质量浓度的L-谷氨酸钠抑制细菌进一步产生 γ-PGA。表 3 不同氮源对 γ-PGA合成的影响Tab. 3 Effect of different nitrogen sources on yeild of γ-PGA [氮源\&吸光光度值（A660）\&γ-多聚谷氨酸产量 / （g/L）\&残留谷氨酸钠量 / （g/L）\&无\&0.048\&0\&18.19\&酵母膏\&0.207\&18.58\&8.97\&黄豆粉\&0.192\&19.32\&9.79\&玉米浆\&0.359\&14.59\&11.57\&大豆蛋白胨\&0.255\&14.41\&11.98\&胰酪蛋白胨\&0.376\&18.55\&9.43\&尿素\&0.087\&9.29\&18.18\&NH4Cl\&0.182\&17.81\&10.12\&（NH4）2SO4\&0.268\&23.91\&5.01\&（NH2）2CO3\&0.054\&8.18\&15.76\&NH4NO3\&0.096\&15.69\&12.67\&NaNO3\&0.082\&7.91\&16.18\&]表4 L-谷氨酸钠对 γ-PGA合成的影响Tab. 4 Effect of sodium hydrogen glutamate on yeild of γ-PGA[L-谷氨酸钠添加量 / （g/L）\&吸光光度值（A660）\&多聚谷氨酸产生量 / （g/L）\&培养基残留谷氨酸钠量 / （g/L）\& 0\&0.101\&8.10\&0\&10\&0.297\&10.44\&12.60\&20\&0.312\&13.58\&16.96\&30\&0.286\&21.32\&15.72\&40\&0.291\&27.22\&0\&50\&0.312\&30.56\&0\&60\&0.324\&41.36\&0\&70\&0.320\&42.90\&0\&80\&0.327\&63.57\&0\&90\&0.318\&62.03\&0\&100\&0.301\&51.79\&0\&110\&0.296\&50.77\&0\&120\&0.287\&48.40\&0\&][0 20 40 60 80 100 120Sodium hydrogen glutamate mass concentration / (g/L)][706050403020100][γ-PGA yield / (g/L)][γ-PGA yieldGell growth][1.000.750.500.250][Orowth of bacteria（A660）]图 3 L-谷氨酸钠的质量浓度对于 γ-PGA的产量及细菌生长量A660的影响Fig. 3 Influence of mass concentration of sodium hydrogen glutamate on yield of γ-PGA and growth of bacteria A6602.4 响应面实验结果2.4.1 模型建立与方差分析 采用 Design Expert8.0 软件对实验结果（表 5）进行回归分析和方差分析（表 5） ，得到的回归方程为：Y=63.76-2.08A+20.42B-5.10C + 0.74AB-4.33AC-1.00BC-1.46A2-27.93B2-2.36C2 ，其中Y为 γ-PGA产量的预测响应值，A，B，C分别为蔗糖、谷氨酸钠、硫酸铵的编码值。表 5 Box-Behnken 试验设计结果Tab. 5 Design results of Box-Behnken experiment[试验号\&A（培养基中蔗糖质量浓度） / （g/L）\&B（培养基中L-谷氨酸钠质量浓度） / （g/L）\&C（培养基中硫酸铵质量浓度） / （g/L）\&Y（发酵产生γ-PGA质量浓度） / （g/L）\&1\&80.00\&70.00\&9.00\&41.90\&2\&50.00\&120.00\&5.00\&58.91\&3\&80.00\&20.00\&7.00\&16.58\&4\&20.00\&20.00\&7.00\&14.79\&5\&50.00\&70.00\&7.00\&68.27\&6\&20.00\&70.00\&9.00\&62.14\&7\&20.00\&70.00\&5.00\&69.33\&8\&50.00\&120.00\&9.00\&52.36\&9\&50.00\&70.00\&7.00\&64.00\&10\&20.00\&120.00\&7.00\&50.67\&11\&80.00\&120.00\&7.00\&55.43\&12\&50.00\&20.00\&5.00\&12.51\&13\&50.00\&70.00\&7.00\&60.33\&14\&80.00\&70.00\&5.00\&66.39\&15\&50.00\&70.00\&7.00\&61.03\&16\&50.00\&70.00\&7.00\&65.18\&17\&50.00\&20.00\&9.00\&10.04\&]由表6可得，回归模型显著，调整后的复相关系数R2 为 0.967 0，说明模型与实际实验拟合程度较好。由表6的回归模型系数的显著性检验结果可知，模型的一次项 A、B、C 均显著，二次项 AC、BC、A2、B2、C2 也显著，表明各因素对 γ-PGA 产量的影响不是简单的线性关系。对拟合得到的方程分析得到预测的最佳培养基组成： 蔗糖60.39 g/L、硫酸铵6.00 g/L、谷氨酸钠93.27 g/L，此时的 γ-PGA 产量为71.356 g/L。2.4.2 响应面分析 借助Design Expert? Software Version 11软件，根据回归模型作出相应的响应曲面和等高线图。由两因素交互等高线图可以直观地判断两因素的交互作用情况，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆则表示两因素交互作用显著。图4表明蔗糖和L-谷氨酸钠对 γ-PGA 的交互作用比较显著，γ-PGA 的产量随蔗糖和L-谷氨酸钠的添加量的增加先逐渐增大后减小，说明过高质量浓度的蔗糖和L-谷氨酸钠均对 γ-PGA的产生起抑制作用。由图5看出蔗糖和硫酸铵对 γ-PGA 的交互作用十分显著，且 γ-PGA含量随着蔗糖和硫酸铵的添加量的增加同样呈现先增大后减小的趋势。图6则表明随着L-谷氨酸钠添加量的增加 γ-PGA的产量先增后减，当发酵培养基中硫酸铵的添加量为1～8 g/L时，γ-PGA的产量先增后减，存在最大值。2.4.3 最优培养基的确定 通过对回归方程进行数学分析得出，最佳培养基组成为： 蔗糖60.39 g/L、硫酸铵6.00 g/L、谷氨酸钠93.27 g/L，此时的 γ-PGA 产量为71.356 g/L。按照优化的培养基组成做验证实验，平行实验3次取平均值，结果为70.285 g/L，与预测值仅相差1.42 %，比优化前的发酵培养基的 γ-PGA产量 （7.253 g/L） 提高约9.69倍，因此用响应面法对培养基进行优化是一种切实可行的方法。2.5 γ-PGA复合叶面肥对辣椒生长和产量的影响2.5.1 γ-PGA复合叶面肥对辣椒幼苗叶片叶绿素含量和根系活力的影响 γ-PGA复合叶面肥的喷施改变了辣椒幼苗叶片叶绿素含量和根系活力。如图7所示，随着复合叶面肥中 γ-PGA浓度的增加，辣椒幼苗叶片叶绿素含量显著提高。特别是定植后60 d，各处理之间均达到了显著差异水平 （P < 0.05）。γ-PGA添加对辣椒幼苗根系活力的作用效果因辣椒幼苗发育阶段表现出不同变化趋势。在定植后30 d，辣椒幼苗根系活力随复合叶面肥中 γ-PGA浓度增加而逐渐下降，作物幼苗的根系活力对于氮素的吸收具有高浓度抑制反馈效应， γ-PGA作为复合叶面肥中的增效剂对于叶片的氮素吸收有促进作用，随着叶面肥中 γ-PGA添加比例的增大辣椒幼苗对于氮素的吸收率更高，对于植株根系活力的抑制则更为明显。至定植后60 d辣椒苗为成熟植株，辣椒幼苗的根系活力在1-4区间表现出显著增加，而大于4区间的各处理间并未表现出显著差异。2.5.2 γ-PGA复合叶面肥对辣椒幼苗总体生长发育的影响 如图8所示，γ-PGA复合叶面肥的喷施主要促进了辣椒幼苗上部茎叶的生长发育。在辣椒幼苗生长发育前期（定植后30 d）相比于空白对照喷施幼苗的株高、叶面积的增长促进显著 （P< 0.05），且增长效果随着复合叶面肥中 γ-PGA浓度的增加而逐步提高，在复合叶面肥中 γ-PGA的添加量达到0.6 g/L的时候对于辣椒幼苗株高及叶面积的增效影响达到顶峰。但其对于辣椒茎粗及茎叶干重的促进作用并不显著。在辣椒幼苗生长发育的后期（定植后60 d），各项生理指标的差异性均达显著水平 （P < 0.05），在复合叶面肥中γ-PGA的添加量达到0.6 g/L的时候对于辣椒幼苗株高、茎粗、叶面积及茎叶干重的增效影响达到顶峰。而对于根系，如表7在辣椒整个幼苗生育期其促进作用均不明显，随复合叶面肥中 γ-PGA添加量增加，根体积和根干重呈现出显著降低的趋势。可能是由于 γ-PGA复合叶面肥喷施促进了辣椒幼苗茎叶生长，抑制了根系生长，最终导致辣椒幼苗根冠比的降低。此外，γ-PGA复合叶面肥的喷施还提高了辣椒幼苗生长发育前期（定植后30 d）壮苗指数。随着辣椒幼苗进一步的生长发育，γ-PGA逐渐提高辣椒幼苗茎粗和茎叶干物质积累量，但辣椒幼苗的壮苗指数在各处理间并未有显著差异。综合来看 γ-PGA复合叶面肥的喷施显苗的壮苗指数在各处理间并未有显著差异。综合来看 γ-PGA复合叶面肥的喷施显著提高了辣椒幼苗株高、茎粗、叶面积、茎叶干重等地上部生长发育参数，降低了辣椒根系干重，与相关文献中描述对于其他作物生产时添加的作用效果一致。表7 不同类型叶面肥对辣椒幼苗根系的影响Tab. 7 Effect of different foliar fertilizer on root of pepper seedlings[叶面肥施用类别\&定植后天数 / d\&根干重 / mg\&根体积 / mL\&根冠比\&1\&\&5.18±0.00\&0.07±0.01\&0.14±0.01\&2\&\&4.98±0.08\&0.08±0.01\&0.14±0.01\&3\&\&4.07±0.12\&0.07±0.02\&0.13±0.01\&4\&30 \&3.66±0.09\&0.06±0.08\&0.12±0.01\&5\&\&3.45±0.18\&0.06±0.38\&0.12±0.00\&6\&\&2.84±0.24\&0.05±0.73\&0.11±0.00\&7\&\&2.01±0.29\&0.06±0.91\&0.10±0.01\&1\&\&70.97±1.00\&0.95±0.21\&0.14±0.01\&2\&\&80.78±122\&0.96±0.55\&0.14±0.00\&3\&\&79.36±0.04\&0.84±0.49\&0.13±0.00\&4\&60 \&78.69±0.46\&0.70±0.70\&0.13±0.01\&5\&\&69.19±0.11\&0.63±0.09\&0.10±0.00\&6\&\&68.26±0.99\&0.52±0.18\&0.09±0.00\&7\&\&54.70±0.15\&0.51±0.22\&0.09±0.01\&]注： 1-7分别代表施用组类别为： 1. 清水 （CK）； 2. 10 g/L 尿素稀释液； 3. 10 g/L 尿素 + 0.2 g/L γ-PGA稀释液； 4. 10 g/L 尿素 + 0.4 g/L γ-PGA稀释液； 5. 10 g/L 尿素 + 0.6 g/L γ-PGA稀释液； 6. 10 g/L 尿素 + 0.8 g/L γ-PGA稀释液； 7. 10 g/L 尿素 + 1.0 g/L γ-PGA稀释液2.5.3 γ-PGA复合叶面肥对辣椒果实发育的影响 如图9所示，γ-PGA复合叶面肥的喷施能有效促进了辣椒果实的生长发育。在辣椒结果盛期，相比于空白对照辣椒的单果质量、果实最大围直径（果粗）、挂果数、单果质量均随着复合叶面肥中 γ-PGA的含量增加而增大，当复合叶面肥中 γ-PGA的质量浓度为0.6 g/L辣时椒单果质量最大，为12.07 cm，而当复合叶面肥中 γ-PGA的含量继续增加时辣椒果实长度增加并不明显达到平台值。当复合叶面肥中 γ-PGA的质量浓度为0.8 g/L辣时椒单果果粗最大，为11.25 cm，而当复合叶面肥中 γ-PGA的含量继续增加时辣椒单果果粗增加并不明显达到平台值。当复合叶面肥中 γ-PGA的质量浓度为0.6 g/L辣时椒单果挂果量最大为9个，而当复合叶面肥中 γ-PGA的含量继续增加时辣椒挂果量增加并不明显达到平台值。当复合叶面肥中 γ-PGA的质量浓度为0.6 g/L时辣椒单果质量最大，为78.84 g，而当复合叶面肥中 γ-PGA的含量继续增加时辣椒果实质量增重并不明显达到平台值。当复合叶面肥中 γ-PGA的质量浓度为0.6 g/L时辣椒单株产量最大，为788.40 g，而当复合叶面肥中 γ-PGA的含量继续增加时辣椒单株产量增加并不明显达到平台值。综合来观察，当喷施的复合叶面肥为10 g/L 尿素 + 0.6 g/L γ-PGA稀释液时辣椒的总体果实品质及发育情况最好产量也最高。3 结 论本研究利用响应面法对实验室分离的一株高产 γ-PGA枯草芽孢杆菌进行优化发酵培养基，在单因素优化实验的基础上，通过响应面法对其发酵培养基进行优化，得到最佳培养基配方为蔗糖60.39 g/L、硫酸铵6.00 g/L、谷氨酸钠93.27 g/L，γ-PGA产量由原来的7.253 g/L提高到70.285 g/L，完成了实验室规模的发酵为后续制备 γ-PGA复合叶面肥提供大量的原材料。分离提纯后的 γ-PGA与尿素复配成 γ-PGA复合叶面肥能在苗期提高辣椒幼苗的多项生理指标。喷施复合叶面肥增加了辣椒叶片叶绿素含量、根系活力以及株高、茎粗和茎叶干重，且表现出明显的剂量效应，能有效提高植株对氮肥的利用率，其中喷施10 g/L 尿素 + 0.6 g/L γ-PGA最为适宜，在节约 γ-PGA用量的同时达到最佳增产效果。肥料未来的发展方向是有机化和生物化。应用微生物制备有机肥料不仅可以减少因大量使用化学肥料对土壤结构的破坏和水源的污染，还可以改善土壤肥力，有利于农业的可持续发展。 γ-PGA的生物可降解性、环境友好性和保肥增效特性使其在生物有机肥料方面有重要的应用前景。