《武汉工程大学学报》  2021年01期 30-37   出版日期：2021-02-28   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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一株产ε-聚赖氨酸菌株的鉴定和发酵优化


ε-聚赖氨酸是1977年日本的 Shima 和 Sakait 在白色链霉菌的发酵液发现的一种对德拉根道夫试验呈阳性的化合物，随着对该物质研究的深入，发现这种物质是由 25~35个L-赖氨酸单体经过α-COOH和ε-NH2 缩聚而成的一种同型氨基酸聚合物，分子量约为3 500~4 500 Da。由于其肽键异于α-聚赖氨酸聚合物中的肽键，所以将这种物质称为ε-聚赖氨酸［1］。ε-聚赖氨酸的结构如图1所示。ε-聚赖氨酸纯品外观为碱白色至淡黄色粉末，略带苦味、吸水性强、溶于水，微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂［2-3］。研究发现，ε-聚赖氨酸在121 ℃下处理60 min仍不会被降解，该物质的等电点为9.0，所以该物质受pH的影响较小［4］。截至目前，相关研究还没有发现其具有确切的三维结构。ε-聚赖氨酸作为一种聚合物，归类于非晶体，因此它没有确切的熔点，当温度超过250 ℃，便开始软化并分解，红外光谱分析表明，ε-聚赖氨酸在 1 680~1 640 nm 和 1 580 ~1 520 nm区间时有强吸收峰［2-3］。ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好和抑菌 pH 范围广等特点逐渐地受到食品、医药和化工行业的关注［5-6］。经研究发现ε-聚赖氨酸可绿色降解，可食用，对人体本身和其它动物均无毒副作用，该物质也不会在人体内积累。早已在韩国、日本、美国等国家应用于食品防腐，随后中国也批准ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂［7-8］。ε-聚赖氨酸还可以应用农产品生长和保鲜［9-12］，应用于生物医学，例如用于干扰素诱导剂、药物载体、药物缓释剂、生物传感器［13-14］、可生物降解性ε-聚赖氨酸树脂制备等［15-17］。随着ε-聚赖氨酸在更加广泛的领域使用，ε-聚赖氨酸的产量需求越来越高，所以提高ε-聚赖氨酸的产量就成了亟待解决的问题之一。筛选到新的菌种以及优化发酵的最适培养基是提高ε-聚赖氨酸产量的重要前期工作。本实验室保存有一株新产ε-聚赖氨酸菌株，本研究对菌株的基本生理生化指标开展检测，并在摇瓶水平响应面优化获得该菌株的最优配方和发酵参数。[ε][a]　[—NH—CH2—CH2—CH2—CH2—CH—C—]　　[NH2]图1　ε-聚赖氨酸的结构Fig. 1　ε-polylysine structure1　实验部分1.1　材　料菌种：白色链霉菌（st10），由本实验室保存。1.2　培养基发酵培养基：甘油50 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，12水磷酸氢二钠3.58 g/L，pH=6.8。固体培养基：高氏1号固体培养基，改良M3G固体培养基（甘油为碳源），M3G固体培养基（葡萄糖为碳源），查氏培养基，gibbons改良固体培养基，贝纳特培养基。1.3　分析方法1.3.1　菌株的生长曲线以及在不同固体培养基上的生长状态　菌种活化：取实验室-20 ℃下保藏在冷冻甘油管中的菌种1环接入贝纳特培养基斜面培养基中，30 ℃培养72 h，革兰氏染色镜检无误后用作活化菌种 。种子培养：取一环活化后的孢子接种于装有液体培养基的三角瓶中培养（250 mL三角瓶装液量50 mL，180 r/min，30 ℃，恒温振荡培养36 h）。摇瓶发酵：在250 mL三角瓶装发酵培养基50 mL，种子液以3%（体积比）的接种量接入发酵培养基中，180 r/min，30 ℃，恒温震荡培养。菌株在不同培养基上的生长：用种子发酵液分别涂布以下培养基：高氏1号固体培养基，改良M3G固体培养基（甘油为碳源），M3G培养固体培养基（葡萄糖为碳源），查氏培养基，gibbons改良固体培养基，贝纳培养基。培养7 d后观察生长情况。菌生长曲线：将M3G液体培养基分装到若干50 mL的小锥形瓶中，每个锥形瓶中装30 mL培养基，接种量为3%（体积比），在条件为180 r/min，30 ℃的摇床中培养，每隔5 h，将1锥形瓶中菌液进行抽滤，然后将所有抽滤所得菌体进行冷冻干燥后称量，得到菌的生长曲线。1.3.2　ε-聚赖氨酸标准曲线制作和产物的鉴定　标准曲线的制备：配制2 mg/mL ε-聚赖氨酸母液，用0.7 mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.9）稀释成为0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.11，0.12 mg/mL的ε-PL标准溶液，分别量取各标准液0.2 mL以磷酸缓冲液为对照加入0.8 mL 0.5 mmol/L甲基橙，30 ℃振荡反应30 min后，8 000 r/min离心5 min，取上清液稀释8倍在465 nm波长处测定吸光度。以ε-聚赖氨酸质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，制作标准曲线。 ε-PL的测量：将离心除菌的发酵液进行稀释，然后取0.2 mL的稀释液加入0.8 mL 0.5 mmol/L的甲基橙溶液，在30 ℃，震荡反应30 min，反应液在8 000 r/min的条件下离心5 min，取上清液稀释适当倍数在465 nm波长处测量吸光度，然后根据标准曲线计算ε-聚赖氨酸的产量。 颜色反应：Dragendorff试剂会与ε-聚赖氨酸发生特异的淡黄色沉淀，可用于定性检测发酵液中是否含有ε-聚赖氨酸。薄层层析：吸取1 mL液体纯化产物至耐热玻璃管，加入1 mL 浓盐酸，盐酸终浓度为6 mol/L，密封后 121℃ 烘箱水解24 h。薄层色谱的展开剂为V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（吡啶）∶V（水） =4∶1∶1∶2，质量分数0.2%茚三酮乙醇溶液为显色剂，毛细管点适量样品，进行室温层析，展开剂前沿距硅胶板顶端1 cm 处时取出硅胶板，溶剂室温挥发后喷洒显色剂，30 ℃培养箱显色后分析。Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测［18］：用改良tricine-SDS-PAGE凝胶电泳方法检测发酵液和ε-聚赖氨酸标准品中目标蛋白的表达，并对其进行蛋白质分子量分析。1.3.3　合适的碳氮源选择　本实验首先进行了单因素的实验，单因素主要做了碳源和氮源，两个因素筛选，确定碳源、氮源的最佳种类，根据文献得知ε-聚赖氨酸的分泌与pH有关，所以同时分别研究了有机氮源酵母和无机氮源硫酸铵对于发酵中pH及菌株繁殖的影响。碳源单因素实验：以葡萄糖、柠檬酸、麦芽糖、纤维素、淀粉、甘油为碳源，碳源浓度均为50 g/L，其余成分浓度为酵母粉5 g/L，硫酸铵10 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，12水磷酸氢二钠3.58 g/L，pH=6.8，接种量为3%（体积分数）进行发酵，从30 h开始后每隔5 h测量ε-聚赖氨酸的浓度。氮源的单因素实验：以酵母粉、玉米粉、大豆蛋白、尿素、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵为氮源，氮源质量浓度均为10 g/L，其余成分为甘油50 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，12水磷酸氢二钠3.58 g/L，pH=7.0，接种量为3%（体积分数）进行发酵，每隔10 h测量发酵液的pH值及ε-聚赖氨酸的产量，在60 h的时候测量发酵液中菌体的重量以及ε-聚赖氨酸的浓度。混合氮源对发酵的影响：将发酵液中的硫酸铵与酵母粉的质量比分别定为3∶1，2∶2，1∶1，1∶2，1∶3，其余成分为甘油50 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，12水磷酸氢二钠3.58 g/L，pH=6.8，接种量为3%（体积分数）进行发酵，每隔10 h测量发酵液的pH值及ε-聚赖氨酸的产量，分析实验结果。1.3.4　Plackett-Burman 试验设计　Plackett-Burman筛选法采用两水平方法进行实验设计，该方法适合从较多的影响因素中分析出不同的因素对研究目标的影响程度，能以最少试验次数使因素的效果得到更好的估计。设计的 N 次实验至多可研究（N-1）个因素，其中（N-4）个实际因素，3 个虚构变量用以估计误差。每个因素取高低两个水平，两水平取值一般高水平为低水平的1～2倍，试验中因素分别为pH，甘油，酵母粉，硫酸铵，硫酸镁，硫酸铁，硫酸锌，磷酸二氢钾，分别用X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8表示，X9，X10，X11为虚构变量。1.3.5　爬坡实验　根据 PB 试验结果设计最陡爬坡试验路径，以计算出的步长梯度减少酵母膏和硫酸铵在培养基中的浓度，并按一定的梯度增加甘油在培养基中的浓度，其余 5 个因素均取初始浓度，发酵60 h后检测发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度，从而确定3个因素的最适合浓度作为响应面中心点。1.3.6　Box-Behnken 设计　Box-Behnken 设计一般用于分析2~5 个因素对于主效应影响的优化试验。在 Box-Behnken 设计前进行PB 试验筛选，将筛选得到的对发酵液 ε-聚赖氨酸产量影响显著的因素作为Box-Behnken设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据相应的试验表进行试验后，使用 Design-Expert 软件对试验结果进行响应面分析，从而能得到最优发酵配方。2　结果与讨论2.1　分子生物学鉴定及型态学特征结果菌株的16s rRNA经过BLAST 比对后，发现 st10与链霉菌属的多个种的 16s rRNA 序列相似性达到99%。如图2所示，菌株st10与NR024723.1 streptomyces albulus strain IMC s-0802和MN611985.1streptomyces platensis strainYBQ90在同一个分支上，同源， 因此确定 st10 菌株为以上链霉菌属中的一个种。如图3所示，结合菌株 st10 的菌丝体不分隔，不断裂为杆状体，孢子成链状符合链霉菌属（Streptomyces）特征。菌株在甲基蓝固体培养基生长产生的透明圈表明菌株分泌酸性物质，符合分泌ε-聚赖氨酸的特征。2.2　菌株的生长曲线及其在不同固体培养基上的生长如图4所示，菌的生长曲线说明，菌的生长对数期在10~40 h之间，之后逐渐达到平衡期。如图5与表1所示，菌株在不同培养基上的生长情况说明菌株对不同的营养物质的利用效率不一样，其中可以明显看出该菌株对甘油的利用效果最好，在贝纳特培养基很容易形成褐色的孢子。而在其它的培养基中的生长旺盛程度与生长状态都很差，这与碳源的单因素试验得出的结论是一样，这说明，该菌株不管在固体培养基还是液体培养基中，最适合生长的碳源均为甘油。[0 10 20 30 40 50 60 70 80 90t / h][0.20.1][Population of bacteria / g]图4　菌的生长曲线Fig. 4　Growth curve of bacteria2.3　标准曲线和产物的鉴定结果标准曲线如图6所示，R2=0.994，线性较好。图7（b）表明配制Dragendorff 试剂加入到发酵上清液中出现明显的淡黄色沉淀，与特异检测结果相一致。图7（a）薄层层析结果显示产物以及标准品的水解液的成分层析位置与单体赖氨酸是一致的，说明产品为赖氨酸单体的复合物。图7（c）tricine-SDS-PAGE凝胶电泳结果显示发酵液与标准品的条带位置是一致的，说明发酵产物与购买的标准品的分子量相近，低于5 000 Da，发酵液与标准品的条带相似，分子量为一个范围值，该结果与目前的大多数菌株分泌的ε-聚赖氨酸性质相似。图6　测量ε-聚赖氨酸的标准曲线Fig. 6　Standard curve for ε-polylysine图7　ε-聚赖氨酸鉴定图：（a）薄层层析，（b）颜色反应，（c）tricine-SDS-PAGE电泳Fig. 7　Identification diagrams of ε-polylysine：（a）thin-layer chromatography， （b）colour reaction，（c）tricine-SDS-PAGE electrophoresis2.4　单因素实验结果如图8（a）所示，不同的碳源实验表明，适合菌株的较好碳源为甘油和葡萄糖，其对甘油的利用效果更好，更有利于前期菌的增殖，以及后期ε-聚赖氨酸的合成，对于柠檬酸，麦芽糖，淀粉，纤维素，这4种碳源的利用率很低，后期的发酵液的混浊程度低，说明菌的浓度很低。根据图4生长曲线和检测发现菌生长到30 h左右达到平衡期才能检测到ε-聚赖氨酸。大量的研究发现，ε-聚赖氨酸的分泌与发酵液的pH有关系。而氮源与发酵液的pH和菌体的增殖均有复杂的关系。实验中氮源的发酵实验表明在单独的氮源中基本都不能检测到ε-聚赖氨酸，如图8（b）所示，显示检测到ε-聚赖氨酸的氮源是因为尿素、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵中的铵根离子会对检测产生干扰。如图8（c）所示菌株没有分泌ε-聚赖氨酸的原因为硝酸铵、硫酸铵、氯化铵虽然能极大降低发酵液的pH，但是菌达不到一定的密度，所以菌体也不会分泌ε-聚赖氨酸。如图8（d）所示大豆蛋白胨，酵母粉有机氮源会促进菌的增殖，但是不利于pH的降低，不能使发酵液pH环境降到4左右，所以也不能检测到ε-聚赖氨酸，这说明该菌株与大部分产ε-聚赖氨酸株相似，只有菌浓达到一定的密度，而且在pH=4左右时才会分泌ε-聚赖氨酸。虽然硫酸铵相对于硝酸铵，氯化铵可以使菌量得到一定的增殖，但是与有机氮源酵母粉和大豆蛋白相比依然较差，由于干扰因素玉米粉不能完全溶于水中，所以玉米粉培养基中菌量是不准确的。综合有机氮源与无机氮源的特点，后期的发酵均采用有机氮源和无机氮源相结合来促进菌体的增殖和ε-聚赖氨酸分泌。2.5　混合氮源如图9（a）所示，通过有机氮源与无机氮源的不同配比发酵实验发现m（酵母粉）∶m（硫酸铵）=1∶2和m（酵母粉）∶m（硫酸铵）=1∶3的时候pH下降的最快，但是最终的pH与初始的氮源配比没有关系，最终的pH均稳定在3.0左右，这说明该菌株能进行pH环境的自我调控，最终将pH稳定在适当的水平。如图9（b）所示，不同氮源中ε-聚赖氨酸的检测发现m（酵母）∶m（硫酸铵）为1∶2的时候ε-聚赖氨酸的产量最高为0.42 g/L，所以ε-聚赖氨酸的产量与混合氮源的比例和种类均有关系。ε-聚赖氨酸产量曲线也说明由于初期铵根离子的影响会影响检测，但随着时间的变化由于铵根离子的消耗导致测量回归正常。2.6　优化实验结果2.6.1　Plackett-Burman 试验设计结果与分析　Plackett- Burman 试验结果如表2所示，得到的数据输入到Design-Expert 软件中进行回归分析，得到每个影响因素的偏回归系数和对发酵产量的显著性，以及它们在发酵中的影响比重。结果显示如表3所示，甘油、酵母粉、硫酸铵对发酵产量的影响占比位于前三，其中正效应因素为甘油，负效应因素为酵母粉和硫酸铵，贡献占比分别为21.78%，33.29%，28.48%。表3　偏回归系数及影响因子的显著性分析Tab. 3　Significance analyses of partial regression coefficients and influence factor [因素 回归系数 P值 影响比例 影响程度排序 pH 0.013 0.214 3 2.240 6 甘油 0.039 0.016 3 21.780 3 酵母粉 -0.049 0.009 0 33.290 1 硫酸铵 -0.045 0.011 2 28.480 2 硫酸镁 0.004 0.615 8 0.280 7 硫酸铁 -0.002 0.805 6 0.066 8 硫酸锌 0.025 0.052 5 8.840 4 磷酸二氢钾 0.013 0.209 8 2.300 5 ]2.6.2　响应面中心点的确定　爬坡实验如表4所示，酵母膏、硫酸铵、以及甘油的质量浓度分别为4，7，55 g/L时ε-聚赖氨酸的质量浓度最大为0.71 g/L。此时m（酵母膏）∶m（硫酸铵）=1∶1.8，将此时的质量浓度作为响应面的中心点。表4　最陡爬坡试验设计及其结果 Tab. 4　Design and results of steepest climb test g/L[编号 e（酵母粉） e（硫酸铵） e（甘油） e（ε-PL） 1 5 10 50 0.53 2 4 7 55 0.71 3 3 4 60 0.33 4 2 1 65 0.25 ]2.6.3　培养基最佳成分的确定　响应面实验结果如表5所示，将得到的发酵产量结果用Design-Expert软件进行响应面分析得到方程模型，响应曲面以及等高线图。利用Design-Expert软件拟合得到的回归方程为：R1=0.78+0.026A+0.079B-0.082C+9.850AB+0.044AC-0.015BC-0.12A2-0.20B2-0.12C2。方程中A，B，C分别表示酵母膏、硫酸铵和甘油的质量浓度，R2=92%显示回归拟合较好。由回归方差分析表6可以看出，该回归模型显著（p=0.004 6<0.050 0），失拟项显著，所以此模型可以用来进行发酵产量的预测。对方程模型进行分析得到模型的最优配方及对应极值点，即酵母粉、硫酸铵和甘油的质量浓度依次为4.05，7.63，53.26 g/L，此时响应面会达到一个最大值，即这时发酵液中ε-聚赖氨酸有最高预测产量为0.807 g/L。模型极值点的验证：为了验证在酵母粉，硫酸铵，甘油的质量浓度依次为4.05，7.63，53.26 g/L时的最大预测值，将此质量浓度下的培养基进行3次平行发酵，60 h后测量发酵液中ε-聚赖氨酸的浓度，计算3次平行发酵产量的平均值为0.724 g/L，与模型极值0.807 g/L相差较小。此时实验室摇瓶发酵的最优配方为酵母粉4.05 g/L，硫酸铵7.63 g/L，甘油53.26 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，12水磷酸氢二钠3.58 g/L，pH=6.8。图10（a）和图10（b）中可以看出在以甘油为中心点时硫酸铵和酵母粉的交互作用比较明显。图10（c）和图10（d）中可以看出在以硫酸铵为中心点时甘油与酵母粉的交互影响显得平缓，这可能是因为计算的步长较小导致的。图10（e）和图10（f）表明在以酵母粉为中心点时甘油与硫酸铵的交互影响也比较显著。3　结　论通过对该新菌株的生理生化的检测以及构建系统发育树的分析表明该菌属于白色链霉菌属，经过一系列发酵产物的分析检测说明发酵产物为ε-聚赖氨酸，其分子量在5 000 Da以下，与大部分的产ε-聚赖氨酸的菌株产物是一样的，但是发酵产量属于中等级别产量菌株。经过单因素的实验表明在固体培养基和液体培养基中最适合菌株生长的碳源均为甘油，在液体培养基中适合促进发酵ε-聚赖氨酸产生的最佳氮源为硫酸铵与酵母粉的混合氮源，无机氮源硫酸铵利于PH的降低，有机氮源酵母粉利于菌株的大量繁殖，两者共同作用于pH与菌量的增长来共同促进产物的生成。响应面的实验结果确定了碳源和氮源的最适质量浓度为酵母粉4.05 g/L，硫酸铵7.63 g/L，甘油53.26 g/L，该条件下的ε-聚赖氨酸的产量为0.724 g/L，略低于模型值，这些数据对ε-聚赖氨酸测量，发酵罐小试，菌株的改造等后续内容奠定了基础。