《武汉工程大学学报》 2021年04期
372-375
出版日期：2021-08-31
ISSN:1674-2869
CN:42-1779/TQ
磷霉素壳寡糖盐的合成与抗菌活性测试
磷霉素是一种从混合链霉菌发酵液中获取的天然广谱抗生素，由美国MERCK公司和西班牙CEP公司发现 ［1］。磷霉素对大肠杆菌、葡萄球菌属、沙雷菌属、志贺菌属等有较强的抑制效果。肽聚糖是细菌合成细胞壁时不可或缺的成分之一，磷霉素与磷酸烯醇丙酮酸结构近似，可以竞争性地与丙酮酸-二磷酸尿嘧啶-乙酰葡糖胺转移酶进行不可逆结合，使得二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡糖胺丙酮酸盐的合成受到阻碍，导致细菌自身无法产生肽聚糖，破坏细菌细胞壁的合成，继而达到抗菌目的［2-4］。壳寡糖是由壳聚糖降解得到的产物，聚合度在2到20之间［5-6］，因其有游离的氨基而呈弱碱性，对多种细菌有抑制作用。同时，生物相容性也是壳寡糖具有的优势之一［7-8］。磷霉素中作为药效团的环氧环不稳定，常以盐的形式存在从而获得较高的稳定性［9］，因而可以利用拼合原理将两种药物拼合在一起，得到的新结构可以改变原有药物的药代动力学，有利于增加药物的稳定性、减少细菌耐药性的产生、降低原有药物的毒副作用［10-12］。根据上述药物拼合理论，本文合成了磷霉素壳寡糖盐，合成路线如图1所示。图1 磷霉素壳寡糖盐的合成路线Fig. 1 Synthesis route of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt1 实验部分1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器 DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，ZF7三用紫外分析仪，旋转蒸发器RE-52C，低温恒温反应浴DFY-5L/40（巩义市予华仪器有限责任公司）；AB204-N 型电子天平（南京安铎贸易有限公司）；SCIENTZ-10N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；GS-2电热鼓风干燥箱（上海实验仪器总厂）；Perkin Elmer傅立叶红外光谱仪（PerkinElmer股份有限公司）；Mercury Plus 400型核磁共振仪（美国Varian公司）。1.1.2 试剂 壳寡糖（浙江金壳药业股份有限公司，纯度>90%，脱乙酰度>70%），磷霉素（R）-1-苯乙胺盐［实验室自制，phosphonomycin（R）-1-phenethylaminesalt，PF］，大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（国药集团化学试剂有限公司），氯型717强碱性阴离子交换树脂（国药集团化学试剂有限公司），其余反应中用到的试剂规格均为分析纯。1.2 实验内容1.2.1 中间体Ⅰ-磷霉素酸的制备 大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂的预处理：将树脂于蒸馏水中浸泡2~3 d，充分活化树脂。取200 mL质量分数（下同）5%的盐酸在搅拌下交换4~5 h，树脂转化为H型后弃去酸液，蒸馏水洗涤树脂到中性；再用适量质量分数5%的氢氧化钠溶液交换4~5 h，转化成Na型后弃去碱液，蒸馏水洗涤树脂到中性；最后再用300 mL质量分数5%的盐酸进行第3次的交换，蒸馏水洗涤树脂到中性备用。磷霉素钠的制备：称取0.578 g（14.450 mmol）氢氧化钠，加5 mL蒸馏水溶解于烧瓶中，室温条件下搅拌10 min制得氢氧化钠溶液；加热到37 ℃，缓慢地加入2.200 g（8.486 mmol）PF，在搅拌下充分反应1 h后分液，静置2 h，待分层完全后，收集下层的磷霉素钠水溶液。中间体Ⅰ磷霉素酸的制备：取已经活化完毕的大孔强酸性苯乙烯系树脂50 mL于250 mL的三口烧瓶，加少量无水乙醇，全程搅拌，预冷至-10 ℃，加入上一步制得的磷霉素钠水溶液，交换15 min，在此温度下从烧瓶中抽滤出液体；再用50 mL预冷的无水乙醇重复2次洗涤树脂，收集洗涤液和抽滤液即为中间体磷霉素酸水溶液。1.2.2 壳寡糖的预处理 氯型717强碱性阴离子交换树脂的预处理：将树脂于蒸馏水中浸泡2~3 d，充分活化树脂。取200 mL质量分数5%的氢氧化钠在搅拌下交换4~5 h后，蒸馏水洗涤树脂到中性；再用适量质量分数5%的盐酸交换4~5 h后，蒸馏水洗涤树脂到中性；最后再用300 mL质量分数5%的氢氧化钠溶液进行第3次交换，蒸馏水洗涤树脂到中性备用。游离壳寡糖的制备：称取6.600 g壳寡糖，用25 mL蒸馏水溶于烧杯，搅拌溶解；量取预处理后的氯型717强碱性阴离子交换树脂100 mL，室温搅拌的条件下交换15 min，抽滤；用150 mL蒸馏水分次洗涤，合并抽滤液和洗涤液即为壳寡糖溶液。1.2.3 目标产物Ⅱ-磷霉素壳寡糖盐的合成 上述步骤制得的磷霉素酸溶液与壳寡糖溶液合并，室温条件下搅拌、反应30 min；55 ℃下减压蒸馏除去乙醇和部分水，液氮预冷后经过冷冻干燥得到6.014 g磷霉素壳寡糖盐固体粉末。2 生物活性测试采用滤纸片法，通过测定抑菌圈的大小比较磷霉素壳寡糖盐的抗菌活性，选取的4种菌株分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌。按照10.000 g蛋白胨、3.000 g牛肉膏、5.000 g氯化钠、20.000 g琼脂溶于500 mL蒸馏水的比例，加热搅拌制得原液；于250 mL三角瓶中分别加入200 mL原液，用棉塞将瓶口塞住，高压灭菌锅中121~126 ℃，0.1 MPa的条件下持续灭菌30 min；移取10 mL于培养皿中，触晃，均匀地把液体平铺在培养皿，静置冷却待其凝固，制得固体培养基。磷霉素单独存在的情况下其活性基团环氧基不稳定，易失去活性；PF为磷霉素盐类合成中间体不能直接临床使用，所以选择磷霉素钙作为磷霉素端测试样品与磷霉素壳寡糖盐进行对比。将5组磷霉素壳寡糖盐、壳寡糖、磷霉素钙分别配制成2 mg/mL的无菌药液，无菌条件下保存。超净工作台灭菌30 min，分别用移液枪量取4种菌株的菌悬液各200 μL于固体培养基，每种菌株分别接种于5个培养基，用三角棒涂布器将菌液均匀涂抹后静置；将2个直径6 mm厚度1 mm的无菌纸片贴入1个固体培养基，标记；分别用移液枪吸取20 μL配置的无菌药液并注入滤纸片上，用封口膜封闭培养基口，置于恒温培养箱中37 ℃下培养16 h，观察并测量产生的抑菌圈的直径，同一样品做3个重复样。3 结果与讨论3.1 制备工艺的初步优化将磷霉素壳寡糖盐对细菌生长的抑制作用作为评价指标，采用3因素5水平的均匀设计试验，以PF与壳寡糖的质量比、反应温度、反应时间作为影响因素，筛选出效果较优的反应条件。按照U5（53）因素水平表进行试验。因素水平表见表1，均匀设计试验安排表见表2。3.2 初步均匀设计及生物活性的测试结果以未添加任何药物溶液的空白纸片培养基作为对照组，相同条件下进行细菌的培养，记录抑菌圈直径。抑菌圈的直径大小反映了药物对细菌生长的抑制作用，抑菌圈的直径越大就意味着药物对细菌的抑制效果越好；反之越差。其中加入壳寡糖的培养基未产生抑菌圈，因此可以认为在此含量的基础上单独使用壳寡糖没有抑菌效果［13］；记磷霉素钙实验组为第6组，磷霉素壳寡糖盐、磷霉素钙对上述4种细菌的抑菌圈实验结果见表3。表3 抑菌圈均匀设计试验结果Tab. 3 Results of tests of uniform design of inhibition zone [药品批号 菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 1 29 18 18 19 2 30 17 14 18 3 30 12 18 21 4 28 8 17 18 5 26 10 16 17 6 28 31 18 24 ]注：抑菌圈直径的单位为mm根据抑菌圈实验的结果可知，3号药物对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的抑制效果最佳，抑制金黄色葡萄球菌的效果中等；结合第6组结果可以知道，对于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌，磷霉素壳寡糖盐的抗菌活性与磷霉素钙的抗菌活性相当；对于金黄色葡萄球菌，磷霉素壳寡糖盐有一定的活性，但磷霉素钙活性更优。以抑菌圈的直径为指标，在考虑到抗菌范围、反应条件和成本因素，初步确定磷霉素壳寡糖盐的最佳制备条件是：PF与壳寡糖的质量比为1∶3，反应温度为25 ℃，反应时间为0.50 h。3.3 谱图分析壳寡糖是一个多聚体，且脱乙酰度很难达到100%，所以磷霉素和壳寡糖成盐的方式众多，无法获得单一结构的盐，因而只能获得以不同方式连接的盐的混合物，但是可以利用红外光谱（infrared spectroscopy，IR）、氢核磁共振（hydrogen nuclear magnetic resonance，H1 -NMR）对其进行表征，验证活性基团是否存在。3.3.1 IR 结合磷霉素钙、壳寡糖的红外谱图进行分析，可以看出3 420.93 cm-1 处的吸收峰是缔合羟基的伸缩振动吸收峰；N-H的伸缩振动吸收峰宽且与羟基峰重叠，比较图2和图3中N-H键吸收峰较弱，其中2 923.14 cm-1处为伯胺成铵盐形成的吸收峰；578.96 cm-1 与1 636.53 cm-1处也是为氨基的特征峰；图3中显示壳寡糖中含有少量未脱去的乙酰基，所以1 636.53 cm-1处也有少量羰基的吸收峰与之重叠；1 071.60 cm-1处是醚键伸缩振动而产生的吸收峰。3.3.2 H1-NMR 从图3可知，化学位移值在1.0处的吸收峰为环氧基上甲基上C-H的吸收峰；化学位移值在3.0到4.0的多重峰为壳寡糖上与氧原子相连C-H的吸收峰和与环氧基上C-H的吸收峰；吸收强度最大的为溶剂重水上氢的吸收峰，化学位移值为4.8，一些活性官能团上的氢原子与重水上的氘原子进行交换，信号消失，如羟基、氨基。[12 10 8 6 4 2 0 -2δ]图3 磷霉素壳寡糖盐的核磁共振氢谱Fig. 3 1H-NMR spectrum of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt4 结 论虽然磷霉素于20世纪40年代就被发现有抗菌作用，但至今仍在对革兰阳性菌和革兰阴性菌乃至部分耐药菌株的实验中表现出不错的活性，在超级细菌事件频出的现在具有较好的研究价值［14-15］。本研究根据拼合原理将磷霉素和壳寡糖结合在一起，采用抑菌圈法验证了磷霉素壳寡糖盐的抗菌活性并与单用磷霉素钙、壳寡糖进行了对比，验证出新型磷霉素壳寡糖盐与磷霉素钙具有相似的活性，达到了丰富磷霉素抗菌药物种类的实验目的；初步确定了反应的最佳条件为PF与壳寡糖的质量比为1∶3，成盐反应的温度为25 ℃，反应时间为0.50 h。此外，本反应条件温和、环境友好、成本低廉，易于实现工业化的生产。