《武汉工程大学学报》  2019年03期 205-212   出版日期：2019-06-20   ISSN:1674-2869   CN:42-1779/TQ

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基于 iTRAQ 技术的肝癌肝郁证唾液蛋白质组学


原发性肝癌（以下简称肝癌）是临床上常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织发布的《全球癌症统计报告2018》指出，中国是世界上癌症发病率和死亡率全球第一的国家［1］。中国肝癌的发病率和死亡率均位列全国第五，每年我国死于肝癌的患者约为40万人，而且近年来我国的肝癌患者数量仍在逐渐增加。原发性肝癌临床上表现为为肝痛、乏力、纳差、发热、消瘦、黄疸等。中医认为肝郁证为肝癌临床常见的证型之一［2］，然而目前对肝郁证肝癌的研究进行的较少，其本质尚不明确。近年来，唾液组学在口腔疾病和全身系统性疾病早期诊断领域备受关注［3-6］。与血清标本相比，唾液具有取样方便、安全无创伤、成本低廉等优点。因此，唾液在人体疾病早期诊断和预后监测中具有巨大的潜力。随着基因表达芯片、高通量测序技术、生物质谱等具有高灵敏度、高通量、高分辨率新技术的快速发展，研究人员已经在唾液中发现了多种临床疾病的诊断标志物。然而目前的研究领域主要集中在口腔癌、头颈癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等疾病［7-9］。国内外对肝癌早期诊断的研究主要基于血清和肝脏组织［10-12］，对肝癌唾液组学的研究还比较少见。本文采用同位素标记相对和绝对定量（isobar labeled relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术，对肝癌不同中医证型进行唾液蛋白质谱分析，筛选肝郁证肝癌相关蛋白，从蛋白质组学角度探讨肝郁证肝癌的发病机制。1　实验部分1.1 　诊断标准1.1.1　西医诊断标准　原发性肝癌的诊断及分期参照2001年第八届全国肝癌学术会议制定并通过的原发性肝癌临床诊断与分期标准［13］。1.1.2　中医辨证分型标准　在确定西医临床诊断为原发性肝癌的基础上，参照文献研究得出的肝郁证参考诊断标准：①胸胁作胀或痛，②精神抑郁，③烦躁易怒 ，④口苦 ，⑤胸闷 ，⑥善太息 ，⑦脉弦。以上 7条同时具备 4条或 4条以上即可诊断为肝郁证［14］。未见以上症状者纳入非肝郁证组。1.2 　排除标准排除年龄在30岁以下；排除已接受过局部放化疗治疗或手术者；排除患有口腔局部及唾液腺炎症患者；排除合并有其他系统严重原发性疾病患者；排除患有舍格伦综合征或囊性纤维病患者。1.3　唾液样本 本次所收集的唾液样本均来自湖南中医药大学第一附属医院肿瘤科临床诊断为肝癌的患者，患者均签署知情同意书。其中，肝郁证肝癌患者11例，男9例，女2例，平均年龄50.4岁，最大患者65岁，最小患者42岁。非肝郁证肝癌患者11例，男8例，女3例，平均年龄57.6岁，最大患者67岁，最小患者40岁。健康对照组11例，男5例，女6例，平均年龄53.2岁。1.4　唾液样本收集及处理1.4.1　唾液样本采集　样本采集前一晚，患者睡前清水漱口3次，避免进任何食物或药物。第二天早上起床后未进食前，采用非刺激性唾液采集方式取样。患者将前5 min内的唾液自然吞下后，专业人员开始操作收集唾液样本。将消毒的无菌圆柱形棉花放入患者口中，当棉花积聚足够量的唾液后，让患者将棉花吐入提前置于冰浴的唾液离心管（15 mL）内。4 ℃下先静置1 h，然后3 000 r/min离心10 min。冰浴上将收集的唾液分装在1 mL的EP（eppendorf）管中，每管分装200 μL，置于-80 ℃冰箱冷冻保存。1.4.2　唾液蛋白提取及定量　取出样本，冰上解冻，样本中加入适量裂解液（由2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素和质量分数0.1%chaps {3-［3-（胆酰胺丙基）二甲氨基［丙磺酸内盐，3-［（3-cholamidopropyl）dimethy lammonio］ propanes ulfonate}组成， 涡旋混匀后超声60 s，在室温提取30 min。在4 ℃下15 000 r/min离心20 min，收集上清，分装后置于-80 ℃冰箱保存。采用Bradford法对提取的蛋白进行定量，蛋白定量后分别将肝郁证组、非肝郁证组、健康对照组各11例样本进行组内混合（每个样本取等量蛋白混合）。每组混合后平均分为两份，共6份。1.4.3　蛋白酶切　分别从6组样本蛋白溶液中取出100 μg蛋白于离心管中，加入4 μL还原试剂60 ℃反应1 h，加入2 μL Cysteine Blocking Reagent，室温反应10 min。往10K的超滤管中加入还原烷基化后的蛋白溶液，12 000 r/min离心20 min，收集上清。加入100 μL溶解液，12 000 r/min离心20 min，并收集上清。在超滤管中加入2 μg胰蛋白酶37 ℃反应过夜；次日12 000 r/min离心20 min，收集酶解消化后的肽段溶液。超滤管中加入50 μL溶解液离心20 min，与上一步合并，共得到100 μL酶解后的样品。1.5　iTRAQ实验1.5.1　iTRAQ标记　每管iTRAQ试剂中分别加入150 μL异丙醇，涡旋振荡后离心。取50 μL样品转移到新的离心管中，对6份肽段混合物进行iTRAQ标记，并等量混合。将标记后的样品涡旋振荡后离心，进行真空冷冻离心干燥后-80 ℃保存。1.5.2　LC-MS/MS分析　用100 uL流动相A溶解iTRAQ标记后的样品，14 000 r/min离心20 min，收集上清液。用400 μg酶解好的牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）进行分离（柱温45 ℃，检测波长214 nm）。取100 uL准备好的样本上样，流速0.7 mL/min。用20 μL 质量分数2%甲醇，质量分数0.1%甲酸复溶高pH反相分离得到的组份，12 000 r/min离心10 min，收集上清上样，采取夹心法上样，上样体积10 μL，分离流速350 nL/min。1.5.3　质谱数据处理　搜库所用数据库为UNIPROT Human数据库，并由MALDI-TOF-TOF 4700型质谱完成质谱分析。质谱原始文件采用AB?Sciex配套商用软件Protein Pilot进行处理。1.6 　生物信息学分析本研究鉴定的差异蛋白采用差异倍数>1.5或<0.67，以及p值<0.05作为筛选标准。通过DAVID［15］数据库对鉴定得到的显著差异表达蛋白进行Gene Ontology（GO）功能注释。GO功能分类包括三大类：生物学过程（Biological Process）、分子功能（Moleculer Function）以及细胞组分（Cellular Component）。同时，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库进行差异蛋白代谢通路富集分析。进一步应用STRING蛋白相互作用网络数据库（https：//string-db.org/）绘制差异蛋白相互作用网络图谱。2　结果与讨论2.1　差异表达蛋白鉴定健康对照组、肝郁组、非肝郁组（每组2个重复）共6组，经iTRAQ标记串联质谱分析后，共同鉴定到的蛋白有1 296个。以差异倍数>1.5或<0.67为筛选标准，与健康对照组相比，肝郁组中具有显著差异表达的蛋白390个，其中显著上调的差异蛋白有201个，显著下调的差异蛋白有189个；非肝郁组中具有显著差异表达的蛋白231个，其中显著上调的差异蛋白有133个，显著下调的差异蛋白有98个。同时，对肝郁组和非肝郁组差异蛋白进行比较分析，得到在两组中同时表达上调或下调的蛋白，以及在各组特异表达的蛋白，结果如图1所示。2.2　生物信息学分析2.2.1　GO功能分类　将肝郁组和非肝郁组中共同表达的130个差异表达蛋白进行GO功能分类，结果如图2所示。在生物学进程方面，差异蛋白主要参与补体激活、视网膜稳态、B细胞激活正调控、免疫反应、吞噬作用等生物学过程。在细胞组分方面，这些蛋白主要位于胞外区等。在分子功能方面，这些差异蛋白主要涉及抗原/受体结合、抗氧化剂活性、酶活性等方面。将肝郁组中特异表达的260个差异表达蛋白进行GO功能分类，结果如图3所示。在生物学进程方面，这些差异蛋白主要参与补体激活、多个信号转导通路、蛋白质水解、免疫反应等。在细胞组分方面，这些蛋白主要位于胞外区等。在分子功能方面，这些差异蛋白主要涉及抗原/受体结合、内切酶活性、蛋白酶结合等。2.2.2　KEGG代谢通路富集分析　KEGG代谢通路富集分析结果显示，肝郁组和非肝郁组共同表达的差异蛋白主要富集在5条代谢通路（p<0.05），见图4（a）。同时，对肝郁组中特异表达的差异蛋白进行KEGG分析发现，这些差异蛋白主要富集在7条代谢通路（p值<0.05），见图4（b）。2.2.3　STRING蛋白互作网络图谱构建　进一步应用STRING蛋白互作网络数据库，对肝郁证肝癌特异表达蛋白之间的相互作用进行预测，并绘制了蛋白相互作用网络图（图5）。肝郁证肝癌蛋白相互作用网络中存在2个主要的蛋白功能模块，分别与蛋白酶体通路和补体途径有关。2.3　蛋白质组学研究与传统肝癌中医辨证分型原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，西医结合中医辨证分型是我国肝癌治疗的一大特点。近年来，随着蛋白质组学检测技术的快速发展，将蛋白质组学研究与传统肝癌中医辨证分型相结合，给传统证候研究带来了新的契机，有利于推动中医药的临床研究［16］。目前已有研究报道利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技术，检测并发现不同中医证型原发性肝癌患者的血清蛋白质谱具有差异性［17-18］。原发性肝癌中医证候错综复杂，肝气郁结证为其中的一种常见证型［2］。肝郁证即肝气郁结证，临床表现为因情志不舒、气机郁滞导致心情抑郁、情绪不宁、胸肋闷胀、易怒善哭等症状［19］。肝郁证的现代病证研究表明，肝郁证涉及神经系统、血液循环系统、内分泌系统和免疫系统等多系统、多器官的病理改变［20］。因此，肝郁证可涉及多种疾病，危害甚大，是中医病症研究的重点研究对象。本研究中，应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选肝郁证肝癌和非肝郁证肝癌病人唾液样本的差异蛋白，发现肝郁证肝癌患者的唾液蛋白表达谱存在明显差异。2.4　肝郁证肝癌特异表达蛋白谱及代谢通路对肝癌肝郁证和非肝郁证的差异蛋白表达谱进行分析，在肝郁证中一共鉴定到260个具有显著差异表达的蛋白，包括124个上调蛋白和136个下调蛋白。KEGG代谢通路富集分析显示，这些差异蛋白主要富集在泛素蛋白酶体通路、自噬溶酶体通路、黏附连接通路等。2.4.1　自噬溶酶体通路　蛋白质合成和降解的平衡是细胞生存的一个重要条件，这种平衡的破坏会导致细胞癌变或死亡。真核细胞中存在两条主要的蛋白质降解途径：蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路。在肿瘤的发生发展中，广泛存在蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路的变异，且两者之间可能存在互补代偿关系［21］。自噬溶酶体通路负责降解受损或多余的蛋白质、器官、脂类等，从而维持体内代谢平衡［22］。自噬溶酶体通路作为细胞的一种自我保护机制，在维持细胞自我稳态和促进细胞生存方面具有重要作用，若自噬未能清除冗余的蛋白质和受损的器官，则会导致DNA损伤的累积，从而导致肿瘤的发生发展 ［23-24］。自噬的这种特点表明其在癌症的发生发展中起着双刃剑的作用，具有促进或抑制肿瘤发展的双重作用。本研究发现，参与自噬溶酶体通路的基因，除了鞘脂激活蛋白原（Prosaposin，PSAP）表达上调外，其他基因的表达量在肝郁证中均表现为下调（图6），包括蜡样脂褐质神经元蛋白5（ceroid-lipofuscinosis neuronal protein 5，CLN5），α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（alpha-N-acetylglucosaminidase，NAGLU）、醌还原酶（quinone reductase，CRYZ）、半胱氨酸蛋白酶1（Cysteine?protease 1，LGMN）、半乳糖苷酶α（Galactosidase Alpha，GLA）和甘露糖苷酶β（Mannosidase Beta，MANBA）。这些蛋白的表达下调可能意味着自噬能力的降低。在肿瘤发生的早期，自噬能力降低使得细胞增殖旺盛，同时DNA受损增加基因组的不稳定性，进而导致肿瘤的发生［25］。因此，这些基因在肝郁证肝癌中的下调表达，提示它们可能与早期肝郁证肝癌的发生发展密切相关。2.4.2　泛素蛋白酶体通路　泛素蛋白酶体通路是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，在人体许多生理活动中起着非常重要的作用，包括转录因子调控、抗原提呈、细胞凋亡调控、细胞周期调控和肿瘤发生调控等［26］。其特殊的蛋白酶体裂解活性能上调或下调某些抑癌基因、转录因子或细胞周期素的表达，从而影响癌症的发生发展［27］。我们的研究发现，肝郁证肝癌特异表达的基因中，参与泛素蛋白酶体通路的基因多数表达量上调（图7），包括PSMB1（Proteasome Subunit Beta 1）、PSMD2（Proteasome 26S Subunit， Non-ATPase 2）、PSMD6（Proteasome 26S Subunit， Non-ATPase 6）、PSME1（Proteasome Activator Subunit 1）和PSMD1（Proteasome 26S Subunit， Non-ATPase 1）。PSMB1是组成20S蛋白酶体的亚基之一，介导泛素依赖的蛋白降解，如MHC-I类抗原的加工提呈等［28］。PSMD2、PSMD1和PSMD6是组成19S蛋白酶体的三个亚基。PSMD2在肺癌中表达量上调，且PSMD2高表达与预后差相关［29］。PSMD1在乳腺癌中表达量同样上调，经研究发现PSMD1失活能够抑制乳腺癌中抑癌基因p53蛋白降解，从而造成p53蛋白累积［30］。蛋白酶体激活因子PSME1为11S调节因子（PA28）α亚基的编码基因，口腔鳞状细胞癌中该基因表达量上调，且与易复发和预后差相关［31］。这些蛋白酶体亚基在多种恶性肿瘤中表达上调提示它们可能与癌症的发生发展相关。同时，STRING蛋白相互作用网络显示，肝郁证肝癌蛋白相互作用网络中存在2个主要的蛋白功能模块，泛素蛋白酶体通路上的PSMB1蛋白正是其中一个功能模块上的核心蛋白。这表明PSMB1有可能成为肝郁证肝癌早期诊断的一个潜在标志物，值得开展进一步研究。3　结　语采用iTRAQ定量蛋白组学技术，从分子水平探讨肝癌不同中医证型间的差异，筛选出肝郁证肝癌与非肝郁证肝癌病人的唾液差异蛋白表达谱，建立了肝郁证肝癌特异的蛋白数据库，并构建了蛋白相互作用网络，将肝郁证肝癌蛋白谱进行了可视化展示。本研究结果显示在肝癌肝郁证中表达异常的蛋白主要与蛋白质降解有关，同时系统评估了位于泛素蛋白酶体通路的蛋白酶体亚基在肝癌中的表达量变化，筛选了一个潜在的肝癌早期诊断标志物蛋白PSMB1，为肝癌防治和中医辨证论治提供了依据。本项目不同中医证型的病例数量相对较少，具有一定的局限性，进一步研究应扩大病例个数，并进行功能实验验证差异蛋白的可靠性，进一步揭示其证候本质和生物学机制。